基金申請(qǐng)講座

1、基金申請(qǐng),第一部分 如何撰寫申請(qǐng)書,一、摘 要（限400字）包括：研究方法、內(nèi)容、目標(biāo)、科學(xué)意義。,如：采用……方法，進(jìn)行……研究， 闡明……機(jī)制或揭示……規(guī)律， 為……奠定基礎(chǔ)／提供……思路。,作用：畫龍點(diǎn)睛效果：引發(fā)評(píng)議專家的興趣，使其產(chǎn)生探個(gè)究竟的好奇心 ——“他到底是怎么做的 ？ ”,采用改良的消減雜交技術(shù)建立老年性白內(nèi)障晶狀體上

2、皮細(xì)胞差異表達(dá)基因文庫(kù)并制備基因芯片，利用此芯片篩選出白內(nèi)障相關(guān)基因。通過基因轉(zhuǎn)染在體和培養(yǎng)的晶狀體上皮細(xì)胞，觀察細(xì)胞的形態(tài)、增殖和凋亡、骨架蛋白及晶狀體蛋白的變化，研究基因的功能。從晶狀體上皮細(xì)胞的角度闡明老年性白內(nèi)障發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制，為防治白內(nèi)障提供新思路和理論依據(jù)。,二、立論依據(jù) 對(duì)基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合國(guó)際科學(xué)發(fā)展趨勢(shì)， 論述科學(xué)意義 對(duì)應(yīng)用基礎(chǔ)研究，著重結(jié)合學(xué)科前沿，圍

3、 繞國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展中的重要科技問題 論述應(yīng)用前景,,,在立論依據(jù)的闡述中，對(duì)研究領(lǐng)域、研究方向、 具體科學(xué)問題的理解 研究領(lǐng)域：白內(nèi)障的研究：包括發(fā)病機(jī)制、預(yù)防、診斷、 治療措施等研究 研究方向：白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的研究：包括環(huán)境因素、致病 靶點(diǎn)、細(xì)胞

4、水平、分子水平研究等 科學(xué)問題：白內(nèi)障發(fā)病過程中的相關(guān)基因研究：包括致病 基因篩選、功能研究、調(diào)控機(jī)制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等,,,,,從研究方向展開,圍繞某一具體科學(xué)問題（本項(xiàng)目研究目標(biāo)）進(jìn)行歸納分析,提出研究設(shè)想,從研究領(lǐng)域切入,,,,,,,研究意義,國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀分析,1、項(xiàng)目的研究意義 存在問題：對(duì)科學(xué)意義的闡述不足或夸大 撰寫方法：

5、 從領(lǐng)域入手，提出主要問題，引出熱點(diǎn)研究方向。 圍繞熱點(diǎn)研究方向進(jìn)行簡(jiǎn)要分析，找出目前尚未解決的具體科學(xué)問題，以此為切入點(diǎn)提出假設(shè)，闡述如果解決了該問題（研究目標(biāo)），對(duì)該領(lǐng)域甚至相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)貢獻(xiàn)（理論意義或應(yīng)用前景）。,,,老年性白內(nèi)障是與年齡相關(guān)的疾病，隨著年齡的增 加，其發(fā)病比率也不斷升高。特別是人類趨向老齡化， 白內(nèi)障的患病人數(shù)還將持續(xù)增加。目前，它已是人類 第一位的致盲

6、疾病。迄今為止, 治療白內(nèi)障唯一有效的 方法是手術(shù)摘除混濁的晶狀體并植入人工晶狀體。雖然 手術(shù)后患者可以恢復(fù)良好的視力，但是不可避免的術(shù)后 并發(fā)癥以及手術(shù)設(shè)備、材料耗資巨大，治療白內(nèi)障所花 費(fèi)的資金已成為世界各國(guó)包括富裕的發(fā)達(dá)國(guó)家嚴(yán)重的醫(yī) 療負(fù)擔(dān)。最近的調(diào)查表明，如果把老年性白內(nèi)障的發(fā)病 時(shí)間延緩10年，白內(nèi)障手術(shù)的數(shù)量就會(huì)減少45%[1]。 所以，一些學(xué)者認(rèn)為通過預(yù)防白內(nèi)障發(fā)生或延緩其發(fā)展

7、 的途徑征服白內(nèi)障已成為一項(xiàng)全球性的社會(huì)和社會(huì)經(jīng)濟(jì) 問題[2]。,但是目前我們對(duì)老年性白內(nèi)障發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)還不十分清楚。多年以來許多學(xué)者的研究結(jié)果證實(shí)晶狀體上皮細(xì)胞在老年性白內(nèi)障發(fā)生中起重要的作用，但對(duì)其中進(jìn)一步的基因調(diào)控知之甚少。如果從參與老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞變化的相關(guān)基因入手，研究基因的生物學(xué)功能，有可能抓住引起白內(nèi)障發(fā)生、發(fā)展的主要環(huán)節(jié)。據(jù)此，本研究擬利用改良的消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)準(zhǔn)確、全面、快速的特點(diǎn)，以

8、晶狀體上皮細(xì)胞為研究對(duì)象，一次性篩選出老年性白內(nèi)障全部有差異表達(dá)的基因，從中再篩選出與白內(nèi)障相關(guān)基因，并著重對(duì)其功能進(jìn)行研究，從基因水平闡明白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制，為防治白內(nèi)障提供新思路和理論依據(jù)。,2、國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀分析（與綜述的區(qū)別） 存在問題： A、低水平重復(fù)：不了解最新進(jìn)展，對(duì)國(guó)內(nèi)外現(xiàn) 狀缺乏真正了解，提出的問題別人已解決。 B、文獻(xiàn)復(fù)習(xí)不全：檢索文獻(xiàn)方法不當(dāng)、選擇關(guān)鍵詞

9、 不妥，甚至人為縮小檢索范圍。 C、總結(jié)表達(dá)不夠：對(duì)國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀缺乏歸納分析， 只是簡(jiǎn)單羅列，缺乏邏輯性和針對(duì)性。 D 、對(duì)方法原理理解不夠：對(duì)研究方法不熟悉，簡(jiǎn) 單移植或夸大其作用，缺乏實(shí)際應(yīng)用的可行性。,,撰寫方法：要緊緊圍繞本次申請(qǐng)項(xiàng)目的主題。 A、從領(lǐng)域切入，簡(jiǎn)要論述國(guó)內(nèi)外研究成果，并引 出當(dāng)前的熱點(diǎn)研究方向。(注意與

10、意義呼應(yīng)) B、從研究方向展開，較詳細(xì)地分析國(guó)內(nèi)外的研究 進(jìn)展，闡明在該方向上存在的問題。 C、圍繞存在的問題，結(jié)合國(guó)內(nèi)外以往的研究結(jié)果、 當(dāng)前的現(xiàn)狀及今后的發(fā)展趨勢(shì)，詳細(xì)論述和分 析這些問題產(chǎn)生的原因，提出該方面的空白點(diǎn)、 未知數(shù)、以及研究的難點(diǎn)、焦點(diǎn)，從而為自己 申請(qǐng)項(xiàng)目確立研究目標(biāo)奠定充分的立論基礎(chǔ)。,,D、對(duì)擬采用的技術(shù)方法

11、進(jìn)行介紹和分析。 成熟的方法重點(diǎn)介紹可以應(yīng)用于本研究的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 新方法在詳細(xì)介紹其原理的基礎(chǔ)上，闡明可以應(yīng)用于本研究的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 需特別注意的問題：必須對(duì)所運(yùn)用的技術(shù)方法的原理、流程尤其是在實(shí)際運(yùn)用中可能出現(xiàn)的問題要十分清楚，絕不能是一種簡(jiǎn)單的移植。 例如：抗體 + 功能基團(tuán)，理論上可以實(shí)現(xiàn)融合，但存在“活性、表達(dá)載體選擇、純化等問題。

12、 E、提出本項(xiàng)目的研究設(shè)想。,,,,防治白內(nèi)障必須針對(duì)其發(fā)病的主要環(huán)節(jié)。多年以來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從不同的角度探討白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)理。就致病的環(huán)境因素講，氧化因子、紫外線輻射、晶狀體周圍環(huán)境中離子濃度改變及一些生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子的改變均與老年性白內(nèi)障的發(fā)生有關(guān)。就研究的部位分，晶狀體中皮質(zhì)與核的蛋白質(zhì)改變及晶狀體纖維的改變與白內(nèi)障的形成有關(guān)，而位于晶狀體前囊膜下單層的晶狀體上皮細(xì)胞在白內(nèi)障的形成中的變化更引人關(guān)注。,因?yàn)榫铙w上皮細(xì)胞是晶狀

13、體中唯一有分裂活性、數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞，它們分裂、分化出晶狀體纖維細(xì)胞、產(chǎn)生晶體蛋白，終生不停息，形成了晶狀體均一、對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，對(duì)維持晶狀體的透明起重要作用。不僅如此，晶狀體上皮細(xì)胞還是晶狀體中受外來刺激影響較早的部位，已有研究證實(shí)老年性白內(nèi)障的晶狀體上皮細(xì)胞還發(fā)生退行性變、細(xì)胞膜通透性增加、細(xì)胞內(nèi)酶活性改變、細(xì)胞數(shù)量減少、凋亡細(xì)胞增多等改變，與單純老化的晶狀體之間存在差異[3-5] 。,體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)多種因素(H2O2、UV-B、晶狀

14、體蛋白的自身抗體)誘發(fā)的白內(nèi)障模型中晶狀體上皮的損傷是晶狀體混濁的主要環(huán)節(jié)[6-8]。因此，從晶狀體上皮細(xì)胞的變化入手探討白內(nèi)障的成因，有可能抓住揭示白內(nèi)障發(fā)病機(jī)理的主要環(huán)節(jié)。而晶狀體上皮細(xì)胞變化的基因調(diào)控機(jī)制是問題的關(guān)鍵所在，也是有待我們深入研究的問題。,白內(nèi)障的形成與晶狀體的老化密不可分，是晶狀體老化的極端表現(xiàn)。晶狀體的老化是多種因素相互作用的結(jié)果，包括基因的和非基因的隨機(jī)變化的不斷積累，也有程序性的、非隨機(jī)性的組織特異性多種基因表

15、達(dá)的改變。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)白內(nèi)障相關(guān)基因的研究主要以下三方面：,一是對(duì)體外培養(yǎng)的晶狀體白內(nèi)障模型及上皮細(xì)胞的研究。UV-B輻射作用誘導(dǎo)的白內(nèi)障中晶狀體上皮細(xì)胞是主要的靶細(xì)胞，其Na-K-ATP酶的活性增加，蛋白質(zhì)的合成和分泌增加；上皮細(xì)胞的凋亡增加，其中有c-fos基因的表達(dá)增加；還有組蛋白H4、H3 的低表達(dá)`和蛋白酶C、β-肌動(dòng)蛋白、γ-肌動(dòng)蛋白基因的高表達(dá)[9-12]。Carper等[13]利用RT-PCR-DD(reverse

16、transcription-polymerase chain reaction differential display)技術(shù)研究H2O2誘導(dǎo)的晶體上皮細(xì)胞的基因差異性表達(dá)結(jié)果顯示NADH脫氫酶4亞基、細(xì)胞色素b、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)減少以及細(xì)胞因子的核蛋白、替代拼接因子2 （alternative splicing factor）、β-三羥基異丁酰輔酶A水解酶基因表達(dá)的增加。,二是利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究。波形纖維蛋白基因（viment

17、in）、雜交的Ⅲ型中間纖維蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出白內(nèi)障，而且有隨小鼠年齡增加白內(nèi)障加重的趨勢(shì)。晶狀體改變的共同特點(diǎn)是晶狀體纖維細(xì)胞分化受抑制[14,15]。Gong等[16]報(bào)告晶狀體的細(xì)胞膜蛋白連接蛋白α3（α3 Connexin）基因敲除小鼠（knockout mouse）在晶狀體形成的早期及纖維細(xì)胞分化早期不受影響，其后出現(xiàn)與晶狀體蛋白溶解有關(guān)的核性白內(nèi)障。 雖然體外實(shí)驗(yàn)和白內(nèi)障轉(zhuǎn)基因小鼠都提示我們一些基

18、因的變化與白內(nèi)障有關(guān)，但是，這些變化的基因是否與老年性白內(nèi)障形成有關(guān)，目前尚缺乏進(jìn)一步的報(bào)告。,三是對(duì)人老年性白內(nèi)障晶體上皮的研究。Lee[17]利用RT-PCR技術(shù)研究顯示前極性白內(nèi)障與核性白內(nèi)障上皮細(xì)胞中纖維連接蛋白、I型膠原纖維、α-平滑肌蛋白、TGF-β1、TGF-β2、TGF-βⅡ型受體、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的基因表達(dá)有差異。Kantorow等[18]利用RT-PCR-DD研究老年性白內(nèi)障與正常晶狀體上皮的基因差異性表達(dá)的初步結(jié)果

19、是老年性白內(nèi)障有三個(gè)高表達(dá)基因和12個(gè)低表達(dá)的基因。但就DD-PCR技術(shù)來講，在實(shí)驗(yàn)中難以解決假陰性、假陽(yáng)性以及克隆全長(zhǎng)cDNA的問題。,上述三方面的研究均取得了不同程度的研究結(jié)果，但由于當(dāng)時(shí)技術(shù)條件的限制都未能全面闡明與白內(nèi)障相關(guān)的基因及其功能。 尋找白內(nèi)障時(shí)晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間差異表達(dá)的基因有可能揭示白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)理。,尋找差異表達(dá)基因的經(jīng)典方法是消減雜交技術(shù)（subtractive hybrid

20、ization, SH），它是……，但是實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜。 經(jīng)過改進(jìn)后的抑制性消減雜交（suppression subtractive hybridization ,SSH是Diatchenko等1996年建立的方法）……簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，但仍然問題很多。 我校生化教研室建立了改良消減雜交技術(shù)[19，20]，其特點(diǎn)是：簡(jiǎn)便易行，能夠獲得目的細(xì)胞特異表達(dá)的全長(zhǎng)基因，對(duì)低豐度基因也能有效分離。,該方法的建立

21、者已利用這一技術(shù)從脂多糖刺激前后的人牙髓細(xì)胞的差異表達(dá)的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達(dá)的基因，其中5個(gè)為新基因。同理，利用此方法也能快速、有效地獲得白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間差異表達(dá)的基因，并克隆到全長(zhǎng)cDNA，為進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和功能研究打下基礎(chǔ)。,基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)，使檢測(cè)差異表達(dá)基因和未知DNA分子變得更快捷、準(zhǔn)確、高效?；蛐酒窃?996年被提出并開始研制的，該技術(shù)是將成千上萬的DNA探針集中到1厘米見方的基片上

22、，利用堿基互補(bǔ)原理，DNA探針中的已知堿基序列與被測(cè)定的未知DNA分子雜交后由標(biāo)記分子標(biāo)記雜交體，經(jīng)自動(dòng)閱讀設(shè)備分析雜交結(jié)果，從而對(duì)檢測(cè)基因進(jìn)行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析，確定未知DNA分子。,由于目前尚沒有針對(duì)白內(nèi)障研究的現(xiàn)成基因芯片，根據(jù)本研究的需要，我們將篩選到的差異表達(dá)的所有基因建立cDNA文庫(kù)，再利用基因芯片技術(shù)制備成基因芯片，以此檢測(cè)多個(gè)樣本中白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間差異表達(dá)的基因，從中進(jìn)一步篩選出白內(nèi)障特異的基

23、因，它們中可能有已知基因，也可能有未知基因。通過以上兩種技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，我們能更快捷、有效、準(zhǔn)確地得到白內(nèi)障相關(guān)基因。,綜上所述，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為研究白內(nèi)障發(fā)生過程中的功能基因及特異調(diào)控基因提供了有利武器。本項(xiàng)目從晶狀體上皮細(xì)胞入手，利用改良的消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)系統(tǒng)研究與白內(nèi)障相關(guān)的基因，并采用對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞和在體晶狀體上皮細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染，探討它們?cè)诰铙w上皮細(xì)胞變化和白內(nèi)障形成中的作用，可望闡明白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞變化的

24、分子生物學(xué)機(jī)制，為防治白內(nèi)障提供新的思路和理論依據(jù)。,3、參考文獻(xiàn) A、文獻(xiàn)類別要全：以英文文獻(xiàn)為主，同時(shí)也要引用 中文文獻(xiàn)--- 國(guó)內(nèi)同行中知名專家的文獻(xiàn)。 B、引文信息要全：文章題目、作者姓名、具體出處 （包括期刊名、年份、卷期、頁(yè)碼等）。 C、文獻(xiàn)年代要新：主要是近五年的文獻(xiàn)，最好能有 07年的最新文獻(xiàn)。,三、研究方案,1、研究目標(biāo)

25、 撰寫要求： 有限目標(biāo)，與研究?jī)?nèi)容相呼應(yīng),如：明確……關(guān)系，揭示……規(guī)律， 闡明……原理（機(jī)制），建立……方法等,,舉例：篩選出與老年性白內(nèi)障相關(guān)的基因，明確部分基因在白內(nèi)障形成中的作用，從晶狀體上皮變化的角度闡明白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)理，為防治白內(nèi)障提供線索。,2、研究?jī)?nèi)容： 存在問題：內(nèi)容過多，一個(gè)研究周期難以完成 內(nèi)容分散，不能集中闡明研究目標(biāo)

26、 撰寫要求：內(nèi)容要適當(dāng)—確保研究周期內(nèi)完成 為目標(biāo)服務(wù)—與目標(biāo)相輔相成 要重點(diǎn)闡述—注意與技術(shù)路線區(qū)別,,,舉例： （1）篩選白內(nèi)障相關(guān)基因：采用改良的消減雜交技術(shù)，獲得人老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞和正常晶狀體上皮細(xì)胞差異表達(dá)的基因片段，建立cDNA文庫(kù)。制備差異表達(dá)基因的基因芯片，利用基因芯片技術(shù)從多個(gè)標(biāo)本的

27、老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中篩選出白內(nèi)障相關(guān)基因。,（2）研究白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)：…… （3）研究白內(nèi)障相關(guān)基因在晶狀體上皮細(xì)胞變化中的作用：…… 觀察指標(biāo)如下： ①存活細(xì)胞數(shù)；②光鏡、透射電鏡下細(xì)胞形態(tài)的變化；③細(xì)胞凋亡檢測(cè)：用原位末端標(biāo)記和連接酶介導(dǎo)PCR方法，從形態(tài)和DNA水平分析細(xì)胞凋亡；④細(xì)胞增殖的檢測(cè)：……；⑤細(xì)胞骨架蛋白的檢測(cè)：……；⑥晶狀體蛋白的檢測(cè)：,3、擬解

28、決的關(guān)鍵問題： 存在問題：抓不住關(guān)鍵問題或抓得不準(zhǔn)。 什么是關(guān)鍵問題 ？ --研究過程中對(duì)達(dá)預(yù)期目標(biāo)有重要影響的某些研究 內(nèi)容或因素。 --為達(dá)預(yù)期目標(biāo)所必須掌握的關(guān)鍵技術(shù)或研究手段。 撰寫要求：找出關(guān)鍵問題，提出解決辦法。,,,,舉例： （1）建立差異表達(dá)的cDNA文庫(kù)： 建

29、立差異cDNA文庫(kù)是篩選老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的前提。為使差異cDNA文庫(kù)具有代表性，我們采取以下解決方案： ①選擇各種類型老年性白內(nèi)障晶狀體的前囊膜、取足夠大量的標(biāo)本（擬取50例標(biāo)本）作為建庫(kù)的mRNA的來源。 ②利用改良的消減雜交技術(shù)可快速、有效地獲得差異表達(dá)的完整cDNA片段。此技術(shù)是本課題組成員主要的研究成果，在應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)中已積累了較豐富的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。,（2）制備基因芯片：

30、制備用于本研究的芯片是篩選老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。制備基因芯片的關(guān)鍵是在 1平方厘米的基片上放上成百上千的不同基因探針而不使它們發(fā)生任何混淆。在制作基因芯片時(shí)做到：①嚴(yán)格按操作程序進(jìn)行；②在標(biāo)本的處理及RNA提取時(shí)避免污染，否則即會(huì)造成嚴(yán)重的損失。只要嚴(yán)格按操作程序進(jìn)行操作就可以避免發(fā)生差錯(cuò)。,（3）在體基因轉(zhuǎn)染： 在體基因轉(zhuǎn)染是進(jìn)行白內(nèi)障相關(guān)基因功能研究的關(guān)鍵。在體的晶狀體上皮細(xì)胞大部分處在靜息狀態(tài)，只有位于赤

31、道前區(qū)的少量細(xì)胞具有分裂活性，而且晶狀體表面有一層膠原性質(zhì)的囊膜包裹。在體晶狀體的基因轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵是如何使大量分裂后細(xì)胞轉(zhuǎn)染，如何使病毒穿過晶狀體的囊膜，針對(duì)以上問題我們擬采取下列方法解決：①選用反轉(zhuǎn)錄病毒的慢病毒載體（ lentiviral vector ），它克服了一般反轉(zhuǎn)錄病毒只能轉(zhuǎn)染有分裂能力細(xì)胞的局限性，對(duì)分裂后細(xì)胞也能有效的轉(zhuǎn)染。這對(duì)在體晶狀體的基因轉(zhuǎn)染有很大的優(yōu)越性。②采用直徑1-2μm玻璃微管在顯微鏡下將病毒載體注入晶狀體

32、的前囊膜下，既不破壞晶狀體的完整性，又可使病毒接觸到囊膜下的上皮細(xì)胞。,4、研究方法 存在問題： 過于簡(jiǎn)單：在方案中只有方法名稱而無具體步驟。 過于繁雜：大量羅列一些常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法。 撰寫要求：以研究項(xiàng)目的需求為前提，盡量采用最適合的方法和手段，并將其操作步驟和關(guān)鍵環(huán)節(jié)體現(xiàn)在技術(shù)路線當(dāng)中。,,,5、技術(shù)路線 存在問題： 不清楚，不詳細(xì)，不可行。

33、 撰寫要求： 清晰、詳細(xì)、注意邏輯性。 撰寫方法： —以時(shí)間順序?yàn)橹骶€設(shè)計(jì)技術(shù)路線 —以研究?jī)?nèi)容為主線設(shè)計(jì)技術(shù)路線 —分大小標(biāo)題，突出邏輯關(guān)系。 —詳細(xì)地寫清楚每個(gè)具體步驟。,,,,（1）人晶狀體上皮細(xì)胞的獲得：老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞取自白內(nèi)障患者手術(shù)中取出的前囊膜（晶狀體上皮細(xì)胞緊貼于前囊膜），直徑約5mm。正常晶狀體上皮細(xì)胞取自角膜移植供體眼的晶狀體，在顯微鏡下撕下前囊膜，直徑約8mm。按文

34、獻(xiàn)提供的方法去除晶狀體纖維細(xì)胞，仔細(xì)清洗以去除血細(xì)胞污染。 （2）建立差異cDNA文庫(kù)：從50例白內(nèi)障手術(shù)患者的前囊膜上取下的晶狀體上皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，從25例正常晶狀體前囊膜上取下的晶狀體上皮細(xì)胞作為對(duì)照組，利用改良的消減雜交技術(shù)[19，20]，獲得差異表達(dá)的cDNA，并建立文庫(kù)。主要的實(shí)驗(yàn)流程如下：,正常晶狀體上皮細(xì)胞 白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞 Promega PolyAT

35、tract® System 1000 mRNA分離 mRNA分離oligo-dT18反轉(zhuǎn)錄 ntech Cap-finder方法反轉(zhuǎn)錄 cDNA Biotin-21

36、-dUTP pending-cDNA 隨機(jī)引物PCR 雜交 Sephacryl S-400柱,,,,,,,,,,,,除鹽及小片段 鏈親和素-生物素磁性分離 除去雜交體及過量正常晶狀體上皮細(xì)胞cDNA

37、 “長(zhǎng)距離”PCR 目的cDNA的特異擴(kuò)增 克隆、鑒定、轉(zhuǎn)化 建立差異基因文庫(kù),,,,,（3）制備基因芯片篩選白內(nèi)障相關(guān)基因： ① 基因芯片的制備： ……… ②白內(nèi)障相關(guān)基因的篩選：……

38、（4）白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)分析： ① 序列測(cè)定：... ... ② 序列的計(jì)算機(jī)分析： ... ... ③ 獲得全長(zhǎng)基因： ... ... （5）基因轉(zhuǎn)染： ① 培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染：…… ② 在體晶狀體的轉(zhuǎn)染：……,6、可行性分析 對(duì)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)的分析 理論分析 研究手段方法分析

39、 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 對(duì)相關(guān)條件的分析 所用特殊實(shí)驗(yàn)材料（試劑）的分析 對(duì)所具備的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行分析 對(duì)項(xiàng)目組成員搭配及其運(yùn)用技術(shù)方法的能力分析,,,(1)關(guān)于建立差異cDNA文庫(kù)： 老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮 細(xì)胞是處在不同狀態(tài)下的細(xì)胞，細(xì)胞基因表達(dá)的改變 是細(xì)胞蛋白功能等改變的基礎(chǔ)。尋找這些有差異的基 因

40、是探索細(xì)胞功能、狀態(tài)變化原因的突破口。利用的 消減雜交技術(shù)是篩選差異表達(dá)基因的有效方法。改良 的消減雜交技術(shù)是我們研究組成員建立的方法，應(yīng)用 此方法已經(jīng)從脂多糖刺激前后的人牙髓細(xì)胞的差異表 達(dá)的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達(dá)的基因，其 中 5個(gè)為新基因，這一研究成果進(jìn)一步證實(shí)了該方法 的可操作性，而且我們?cè)谶\(yùn)用此方法過程中也積累了 較豐富的經(jīng)驗(yàn)，因此，本研究利用這一方法從兩種狀 態(tài)的晶狀

41、體上皮細(xì)胞中篩選差異表達(dá)的基因并建立 cDNA文庫(kù)是可行的。,7、創(chuàng)新性 存在問題： 對(duì)創(chuàng)新點(diǎn)提煉不夠 把運(yùn)用新技術(shù)、新方法理解為創(chuàng)新 與研究目標(biāo)、研究?jī)?nèi)容相混淆 對(duì)創(chuàng)新的理解： 原始創(chuàng)新：填補(bǔ)空白或修改傳統(tǒng)的理論 發(fā)明創(chuàng)造新技術(shù)、新方法 跟蹤創(chuàng)新：補(bǔ)充

42、、完善現(xiàn)有理論 修改、完善現(xiàn)有技術(shù)方法（1＋1＞2） 提煉方法：用逆向思維方法提煉創(chuàng)新點(diǎn),,,,（1）基因篩選方法上的創(chuàng)新： 首次采用改良的消減雜交技術(shù)建立白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞差異表達(dá)基因文庫(kù)，并制備相應(yīng)的基因芯片，利用此基因芯片篩選出老年性白內(nèi)障相關(guān)基因。上述兩種方法的有機(jī)結(jié)合使我們能快速、準(zhǔn)確、定性、定量地獲得多個(gè)白內(nèi)障相關(guān)基因。通過分析這些基因的結(jié)構(gòu)、研究它們的功能，揭示老

43、年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞變化的分子生物學(xué)機(jī)制，為防治白內(nèi)障提供新的思路。 （2）基因功能研究上的創(chuàng)新：......,8、年度研究計(jì)劃及預(yù)期研究結(jié)果 年度研究計(jì)劃： 按年度列出研究?jī)?nèi)容及其階段目標(biāo) 擬組織的重要學(xué)術(shù)交流活動(dòng)、國(guó)際合作與交流計(jì)劃 預(yù)期研究結(jié)果： 理論成果：建立/豐富/補(bǔ)充/填補(bǔ) ...... 技術(shù)方法：建立/

44、完善 …... 專 利：可望獲得 …… 論 文：國(guó)際、國(guó)內(nèi) 人才培養(yǎng)：青年科技骨干、博碩研究生,,,四、研究基礎(chǔ) 1、研究工作積累 存在問題： 內(nèi)容過簡(jiǎn)； 與申請(qǐng)項(xiàng)目無關(guān)。 撰寫要求： 介紹與申請(qǐng)項(xiàng)目直接相關(guān)的預(yù)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果； 提供相關(guān)的研究論文、成果及專利等材料；

45、 以往應(yīng)用與申請(qǐng)項(xiàng)目有關(guān)的技術(shù)方法的經(jīng)歷； 工作積累也要包括項(xiàng)目組成員的所有信息。,,,（1）有關(guān)消減雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)的工作基礎(chǔ): 本研究所用的基因篩選技術(shù)主要是改良的消減雜交技術(shù)，此技術(shù)是我們研究組成員主要參與建立的，并利用此技術(shù)從脂多糖刺激前后的人牙髓細(xì)胞的差異表達(dá)的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達(dá)的基因，其中5個(gè)為新基因，有關(guān)此技術(shù)的研究論文有：...... （2）有關(guān)基因

46、轉(zhuǎn)染方面的研究工作基礎(chǔ)：...... （3）有關(guān)老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的研究基礎(chǔ)：......,2、工作條件 實(shí)驗(yàn)室整體實(shí)力和規(guī)模（地位、課題、成果等） 實(shí)驗(yàn)室所具備的與申請(qǐng)項(xiàng)目相關(guān)的主要儀器設(shè)備 實(shí)驗(yàn)室所在單位具備的申請(qǐng)項(xiàng)目所需的實(shí)驗(yàn)條件 3、項(xiàng)目組人員簡(jiǎn)歷 所有人員均需介紹（重點(diǎn)是項(xiàng)目負(fù)責(zé)人） 介紹內(nèi)容根據(jù)在項(xiàng)目

47、中的分工有所側(cè)重 列出與申請(qǐng)項(xiàng)目相關(guān)的研究論文及成果,第二部分撰寫申請(qǐng)書時(shí)常見問題解析,1、對(duì)立論依據(jù)、實(shí)驗(yàn)方案、研究基礎(chǔ)應(yīng)闡述的內(nèi)容 以及三者關(guān)系的理解 立論依據(jù)：闡述背景和理由，回答“為什么” 實(shí)驗(yàn)方案：是申請(qǐng)書的核心，回答“怎么做” 研究基礎(chǔ)：展示積累和實(shí)力，回答“做了啥”,一、對(duì)部分撰寫內(nèi)容及其相互關(guān)系

48、的理解,2、對(duì)研究目標(biāo)的確定 國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀分析中提出的具體科學(xué)問題就是項(xiàng)目的研究目標(biāo)。 研究目標(biāo)具體到什么程度，要根據(jù)研究周期、資助強(qiáng)度來確定。,3、研究目標(biāo)、研究?jī)?nèi)容、研究方法的關(guān)系 依據(jù)目標(biāo)確定研究?jī)?nèi)容 根據(jù)內(nèi)容選擇研究方法,4、研究?jī)?nèi)容與技術(shù)路線的區(qū)別 研究?jī)?nèi)容：根據(jù)總體目標(biāo)分若干分題，重點(diǎn)回答

49、 做什么—觀察指標(biāo)、階段目標(biāo) 技術(shù)路線：重點(diǎn)回答怎么做—在具體步驟中體現(xiàn) 研究?jī)?nèi)容和研究方法,5、對(duì)擬解決的關(guān)鍵問題與可行性分析撰寫時(shí)的區(qū)別 二者相同之處：擬解決的關(guān)鍵問題在可行性分析時(shí)也要提及 二者不同之處： 撰寫擬解決關(guān)鍵問題，重點(diǎn)回答如何解決。 解決辦法包括：通過研究思路的設(shè)計(jì)巧妙

50、 運(yùn)用最新出現(xiàn)的研究方法 通過不同方法各自優(yōu)點(diǎn)的有機(jī)結(jié)合 在進(jìn)行可行性分析時(shí)，重點(diǎn)回答能夠解決。 分析問題角度：通過對(duì)現(xiàn)有理論分析提供理論依據(jù) 通過對(duì)預(yù)研結(jié)果分析提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)

51、 通過對(duì)他人研究成果描述提供佐證,6、創(chuàng)新點(diǎn)、研究目標(biāo)和預(yù)期研究結(jié)果的區(qū)別 三者的共同點(diǎn)：都包含一個(gè)“新”字。 三者的不同點(diǎn)：概念的外延不同。 創(chuàng) 新 點(diǎn)： ① 形態(tài)學(xué)證實(shí)在腦下垂體中確有神經(jīng)纖維存在 ② 進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)是肽能神經(jīng)

52、 研究目標(biāo)：通過各種形態(tài)學(xué)研究充分證明在腦下垂體中確 有肽能神經(jīng)支配 預(yù)期研究結(jié)果：提出腦下垂體肽能神經(jīng)和體液雙重調(diào)節(jié) 假說，對(duì)原有理論提出挑戰(zhàn)。,,,二、尚需注意的幾個(gè)問題 1、在項(xiàng)目設(shè)計(jì)過程中要樹立整體觀念，要