單抗系列培訓(xùn)完整版

1、單克隆抗體,分享人：李 行,,2017.08,單抗基本概念,單抗發(fā)展歷程,單抗制備原理,單抗實(shí)際應(yīng)用,實(shí)驗(yàn)存在的問(wèn)題,報(bào)告內(nèi)容,,單抗簡(jiǎn)介,,1975年Kohler和Milstein建立了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，使經(jīng)綿羊紅細(xì)胞（SRBC）免疫的小鼠脾細(xì)胞和小鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合，創(chuàng)立了第一個(gè)B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株，獲得了抗SRBC的單克隆抗體。單抗技術(shù)的問(wèn)世，不僅帶來(lái)了免疫學(xué)領(lǐng)域里的一次革命，而且它在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域獲得極廣泛的應(yīng)用，促進(jìn)

2、了眾多學(xué)科的發(fā)展。因此說(shuō)單抗技術(shù)是免疫學(xué)，乃至醫(yī)學(xué)史上的一個(gè)里程碑。,抗體生產(chǎn)技術(shù)的三個(gè)時(shí)代：多克隆抗體 單克隆抗體 基因工程抗體,,1.抗原 1.1 傳統(tǒng)抗原基本概念：能啟動(dòng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，且能與其免疫應(yīng)答產(chǎn)物(抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞)特異性結(jié)合，并產(chǎn)生一系列

3、生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)。,1.2 現(xiàn)代抗原概念：能被B細(xì)胞免疫球蛋白受體識(shí)別或與主要組織相容性復(fù)合體（MHC）結(jié)合后能被T細(xì)胞受體識(shí)別的物質(zhì)統(tǒng)稱為抗原。,1.3 抗原的兩種基本特性：（1）免疫原性：指抗原分子能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答（產(chǎn)生特異性抗體及免疫效應(yīng)細(xì)胞）的性質(zhì)。,（2）反應(yīng)原性：指抗原分子與免疫應(yīng)答產(chǎn)物（抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞）發(fā)生特異性結(jié)合的性質(zhì)。,1.4 完全抗原與半抗原,（1）完全抗原：具有免疫原性和反應(yīng)原性的物質(zhì)。（2）

4、半抗原又稱不完全抗原：無(wú)免疫原性，只有抗原性的物質(zhì)。（3）載體（carrier）：與半抗原結(jié)合使其成為免疫原的物質(zhì)。如BSA，OVA半抗原+ 載體􀃆完全抗原,1.5 抗原表位（抗原決定簇）：指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)。即抗原上可以引起機(jī)體產(chǎn)生抗體的分子結(jié)構(gòu)。一個(gè)抗原可以有許多不同的抗原決定簇。,抗體（Antibody,Ab）基本概念：機(jī)體免疫細(xì)胞被抗原激活后，由分化成熟的終末B細(xì)胞-漿細(xì)胞合成、分泌

5、的一類(lèi)能與抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的免疫球蛋白。,,3.免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）： 具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體分子相似的球蛋白。,2 .抗體,備注：Ab= Ig, Ig≠Ab,Ab是功能描述，Ig是化學(xué)結(jié)構(gòu)的描述。,基本結(jié)構(gòu)： 重鏈（heavy chain，H）2條 輕鏈（light chain，L）2條 可變

6、區(qū)（variable region, V區(qū)） 恒定區(qū)（constant region, C區(qū)） 超變區(qū)（hyper-variable region, HVR),又稱互補(bǔ)決定 區(qū)（complementarydeterminingregion, CDR） 骨架區(qū)（framework

7、region,FR） 鉸鏈區(qū)（hinge region）,3.1 免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)?,,,,可變區(qū),Ig的兩條長(zhǎng)鏈稱為重鏈（Heavy chain， H鏈），重鏈可分為：μ γ α δ ε　，對(duì)應(yīng)的Ig的種類(lèi)： IgM, IgG, IgA, IgD, IgE.,Ig的兩條短鏈稱為輕鏈，可分為κ， λ??；每個(gè)Ig分子的兩條輕鏈完全相同。,4. 多克隆抗體（polyclonal anti

8、body,PcAb）：指由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對(duì)抗原物質(zhì)中多種抗原決定簇的多種抗體混合物。如：免疫血清（含多種特異性抗體）。,5. 單克隆抗體（monoclonal antibody，McAb）：是由淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的、只針對(duì)復(fù)合抗原分子上某一單個(gè)抗原決定簇的特異性抗體。,6.細(xì)胞克隆：由一個(gè)細(xì)胞增殖而成的細(xì)胞群體。,克隆能夠保持親本的絕大部分性狀。,8. 多克隆抗體和單克隆抗體的優(yōu)劣勢(shì),,融合,在具有篩選作用的培養(yǎng)基中培養(yǎng),篩選

9、出分泌抗體的細(xì)胞，進(jìn)行克隆化,,SP2/0,B細(xì)胞和SP2/0死亡,1. 抗原制備 不管是制備單抗還是多抗，抗原的設(shè)計(jì)與制備都是一個(gè)非常重要的問(wèn)題，設(shè)計(jì)或者制備得不好的抗原有可能完全不能免疫出抗體來(lái)。,1.1 一個(gè)良好的抗原必須具備的條件：（1） 分子量：一般是分子量越大，免疫原性越強(qiáng)，對(duì)于多肽或蛋白質(zhì)類(lèi)的抗原來(lái)說(shuō)，一個(gè)抗原決定簇（又叫表位，epitope），通常由6-8個(gè)氨基酸殘基組成。而平均每5-10kD 才有一個(gè)表

10、位，因此分子太小的多肽或蛋白是很難有一個(gè)表位的。,,（2）化學(xué)結(jié)構(gòu)與組成：結(jié)構(gòu)盡量復(fù)雜。簡(jiǎn)單重復(fù)的物質(zhì)是不具有免疫原性的，拿明膠來(lái)說(shuō)，它的分子量非常大，而且外源性也很強(qiáng)，但是組成明膠的氨基酸多為直鏈氨基酸，在體內(nèi)容易被降解，因此它的免疫原性很弱。蛋白質(zhì)：a.氨基酸組成：含芳香族氨基酸（特別是酪氨酸），免疫源性強(qiáng)。b.結(jié)構(gòu)：環(huán)狀的免疫原性強(qiáng)；直鏈，免疫原性弱。多糖：具有免疫原性，較蛋白質(zhì)弱。核酸：多無(wú)免疫原性。,（3） 外源性強(qiáng)。在

11、個(gè)體形成的早期就對(duì)自身物質(zhì)形成了免疫耐受，因此如果和機(jī)體內(nèi)的物質(zhì)完全一樣或者是相似就很難引起機(jī)體的免疫應(yīng)答。,（4）可降解性好。作為抗原，必須是可以降解的，塑料、不銹鋼等難降解的物質(zhì)免疫原也很弱。含L-氨基酸的蛋白質(zhì)易降解，具有免疫原性。但是由D-型氨基酸組成的物質(zhì)免疫原性很弱，同樣是因?yàn)闄C(jī)體不能降解D-氨基酸組成的蛋白或多肽。,2. 免疫方案,2.1 動(dòng)物的選擇：常見(jiàn)的可以用來(lái)制備抗體的動(dòng)物有：小鼠、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、兔、綿羊、山羊、

12、馬、驢、奶牛，還有用雞或者鴨的。需考慮的問(wèn)題：第一個(gè)問(wèn)題是能否具有較好的免疫效果.第二個(gè)問(wèn)題是抗血清產(chǎn)量的問(wèn)題.,2.2 免疫佐劑：先于免疫原或同時(shí)與抗原混合注射機(jī)體可增強(qiáng)抗原的免疫原性的物質(zhì)。,（1）顆?？乖庖咝詮?qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果，如細(xì)胞類(lèi)抗原、電泳跑蛋白膠。（2）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑。油性佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑；無(wú)機(jī)化合物微生物及其產(chǎn)物脂質(zhì)體細(xì)胞因子,2.4 抗原與佐

13、劑的乳化,2.5 免疫途徑：（1）體內(nèi)免疫：皮下，腹腔，肌肉，靜脈等（2）體外免疫：較少。,2.3 免疫劑量：根據(jù)免疫原、免疫途徑、免疫動(dòng)物、免疫佐劑有關(guān)。 一般的免疫劑量是微克級(jí)別。,2.6 免疫時(shí)間間隔：一般間隔2-3個(gè)星期。,抗體產(chǎn)生的一般規(guī)律,初次應(yīng)答：抗原初次進(jìn)入機(jī)體產(chǎn)生的應(yīng)答。,特點(diǎn)：潛伏期（誘導(dǎo)期）長(zhǎng)（7-10天）； 抗體的種類(lèi)以IgM為主； 抗體的親和力低；

14、 維持時(shí)間短； 總抗體水平低。,再次應(yīng)答：抗原再次進(jìn)入機(jī)體所產(chǎn)生的應(yīng)答。,特點(diǎn)：潛伏期短（約2-3天）； 抗體的種類(lèi)以IgG為主； 抗體的親和力比初期應(yīng)答明顯增強(qiáng)； 維持時(shí)間長(zhǎng)； 總抗體水平高。,3. 免疫鼠血清的采集和檢測(cè),小鼠第三次免疫1 周后，免疫組對(duì)小鼠進(jìn)行眼球靜脈采血，收集血清，血清交由檢測(cè)負(fù)責(zé)人，該

15、負(fù)責(zé)人對(duì)血清進(jìn)行檢測(cè)。,（1）免疫酶技術(shù)：ELISA，IPMA（2）免疫熒光技術(shù)：IFA（3）間接血凝實(shí)驗(yàn)（4）放射免疫檢測(cè),4. 雜交瘤細(xì)胞株的建立,√ SP2/0的準(zhǔn)備,√ 飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備,√ 脾細(xì)胞（B細(xì)胞）的制備,√ 脾細(xì)胞和SP2/0的融合,單克隆抗體的制備與鑒定,雜交瘤的篩選,√,細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇,√,√,實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵！??！,4.1 試劑和耗材,4.1.1 試劑： DMEM 、 胎牛血清（FBS）、 HAT

16、 、 HT 、 50%PEG ， 青、鏈霉素、生理鹽水;,4.1.2 儀器：生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱、水平離心機(jī)、倒置顯微鏡；,工具：止血鉗，剪刀、直頭眼科鑷子、彎頭眼科鑷子,4.2,進(jìn)行細(xì)胞融合的前一天，準(zhǔn)備飼養(yǎng)層細(xì)胞：8-10周齡BALB/c雌性小鼠;用注射器向腹腔內(nèi)注射DMEM，輕輕揉壓小鼠腹膜，抽出腹腔內(nèi)液體，收集到一個(gè) 離心管中，反復(fù)操作3次左右;離心1000rpm ,5min ,棄上清，重懸細(xì)胞，鋪板密度2

17、x105。,實(shí)驗(yàn)流程,4.2.2 準(zhǔn)備飼養(yǎng)層細(xì)胞: 取靜止?fàn)顟B(tài)的腹腔巨噬細(xì)胞,4.2.1 骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的培養(yǎng)：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,4.2.3 脾細(xì)胞（B細(xì)胞）的制備：融合前3天加強(qiáng)免疫小鼠,（1）注射器反復(fù)吹打法（2）研磨法,（1）生物方法：病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞融合（2）化學(xué)誘導(dǎo)：PEG誘導(dǎo) 50%PEG(1000~4000)（3）物理誘導(dǎo)：電融合,4.2.4 脾細(xì)胞和SP2/0的融合：融合方法主要有以下幾種方法,細(xì)胞融合,融合過(guò)程

18、中的注意事項(xiàng)：（1） SP2/0細(xì)胞和免疫脾細(xì)胞的數(shù)量比例適當(dāng)，1:5-1:10；（2）兩種細(xì)胞狀態(tài)要好，洗吹細(xì)胞一定要輕柔；（3）PEG融合之后，加培養(yǎng)基中和時(shí)要緩慢，以免破壞融合的細(xì)胞。,雜交瘤細(xì)胞的篩選（第一次篩選）,5、陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選（第二次篩選）：篩選時(shí)機(jī)的把握,（1）免疫酶技術(shù)：ELISA應(yīng)用最多。,（2）免疫熒光技術(shù)：IFA（3）間接血凝實(shí)驗(yàn)（4）放射免疫檢測(cè) （5）免疫印跡分析（6）免疫沉淀（7）免

19、疫組化和功能中和試驗(yàn),重要思考：“你的抗體用于什么就用什么去篩”，篩選策略必須能夠反映所需抗體隨后的用途。,選擇篩選策略時(shí)，必須要考慮下面的因素：（1）能夠處理多達(dá)1000個(gè)樣品（約120ul/樣品）的能力；（2）48h內(nèi)能夠完成鑒定的能力；（3）是否具備必要的試劑/設(shè)備；（4）反應(yīng)的特異性；（5）實(shí)驗(yàn)體系的靈敏度；（6）最重要的是否能得到結(jié)果。,篩選時(shí)融合前的免疫血清作為陽(yáng)性對(duì)照，這樣確保所有的技術(shù)、試劑、設(shè)備是最合適的。

20、同樣，用培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。,6、雜交瘤細(xì)胞的克隆化：指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。目的是將抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、特異性抗體分泌細(xì)胞和無(wú)關(guān)抗體分泌細(xì)胞分開(kāi)。6.1 克隆化的原則：盡早進(jìn)行，一般要進(jìn)行2-3次克隆。,6.3 克隆化的方法主要包括以下：,克隆之前制備飼養(yǎng)細(xì)胞,6.2,（1）有限稀釋法: 其原理是，將培養(yǎng)孔內(nèi)細(xì)胞用槍或吸管吹打使之懸浮，然后用計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，最后按每孔0.5-1個(gè)細(xì)胞的量將原孔細(xì)胞稀釋滴

21、至新的培養(yǎng)板上（事先制備好飼養(yǎng)層細(xì)胞），培養(yǎng)一段時(shí)間以后就可以看到部分孔有單個(gè)克隆形成（理論上講最終每孔的細(xì)胞個(gè)數(shù)在整體上服從泊松分布） 優(yōu)點(diǎn):a、最簡(jiǎn)單的克隆化方法；b、不需要太多的儀器設(shè)備，操作也不復(fù)雜。 缺點(diǎn)：a、由于計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確或者移液器的偏差，最終導(dǎo)致操作結(jié)果不理想； b、由于細(xì)胞經(jīng)過(guò)吹打的剪切力破壞，細(xì)胞也不一定能夠按期望生長(zhǎng)。,（2）半固體培養(yǎng)法: 原理和做分子克隆時(shí)的菌落篩選有點(diǎn)類(lèi)似半固體培養(yǎng)原理和做分

22、子克隆時(shí)的菌落篩選有點(diǎn)類(lèi)似;其方法是將雜交瘤細(xì)胞與液體低融點(diǎn)的瓊脂糖或甲基化纖維素溶液混合，然后將其倒入含有事先制備的飼養(yǎng)層的培養(yǎng)板上，冷后后培養(yǎng)基呈固態(tài)，在37℃培養(yǎng)一段時(shí)間后，單個(gè)雜交瘤細(xì)胞會(huì)形成類(lèi)似菌落的小克隆，可以用槍頭將其挑出到培養(yǎng)板上在液體培養(yǎng)基里培養(yǎng)，這樣也可以實(shí)現(xiàn)克隆化。 優(yōu)點(diǎn)：a、操作比較直觀簡(jiǎn)單， 缺點(diǎn)：對(duì)半固體培養(yǎng)基的要求比較高，容易出現(xiàn)細(xì)胞不生長(zhǎng)或者污染情況發(fā)生。,（3）顯微操作法  把

23、陽(yáng)性孔里的細(xì)胞稀釋到足夠稀，靜置半小時(shí)后細(xì)胞會(huì)沉淀到孔底，然后在顯微鏡下用槍直接吸取一個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的孔內(nèi)培養(yǎng)即可。優(yōu)點(diǎn)：最初級(jí)、最直觀、最省腦力和人力的辦法，步驟簡(jiǎn)單。,（4）熒光激活細(xì)胞分離法：流式細(xì)胞術(shù),7. 細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇,及時(shí)對(duì)各階段陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行凍存,凍存步驟： （1）吹下需凍存的細(xì)胞； （2）1000rpm 離心5 min，棄上清； （

24、3）用凍存液將細(xì)胞重懸，之后凍存； （4）將細(xì)胞放入細(xì)胞凍存盒內(nèi)，然后將其直接放入-80℃冰箱 過(guò)夜（不小于12h），之后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮中。,細(xì)胞復(fù)蘇步驟：（1）從液氮中取出細(xì)胞，迅速置于37℃水浴鍋中融化細(xì)胞；-----快?。。。?）直接將細(xì)胞加入瓶（25cm2）中，并加入含20% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng),12小時(shí)后，充去上清，換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。,8. 單

25、克隆抗體的生產(chǎn),8.1 在產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞分離、克隆并凍存建庫(kù)后，擴(kuò)增雜交瘤細(xì)胞可以生產(chǎn)抗體。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清可產(chǎn)生3-20ug/ml 的抗體。----抗體產(chǎn)量低,8.2 目前單克隆抗體生產(chǎn)包括腹水制備和細(xì)胞培養(yǎng)兩種方法。,8.2.1腹水制備流程：（1）提前7天，小鼠腹腔注射0.5ml石蠟油；（2）小心吹打細(xì)胞瓶底部，使細(xì)胞從瓶底脫落，收集細(xì)胞；（3）室溫1200r/min離心6 min，棄上清；（4

26、）用不完全培養(yǎng)液DMEM或生理鹽水按照0.5ml/只鼠懸浮細(xì)胞；（5）將細(xì)胞懸液注射到小鼠腹腔；（6）7-10天后小鼠腹腔明顯鼓起后，采集腹水。,8.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)單抗：利用滾瓶、轉(zhuǎn)瓶和CELLine 瓶制備單抗。（1）在單克隆抗體的產(chǎn)量方面，滾瓶和轉(zhuǎn)瓶較一般的細(xì)胞培養(yǎng)瓶只有少許優(yōu)勢(shì)。（2） CELLine ：膜式雙室技術(shù)的一種的體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。,9、單抗特性的檢測(cè)：,9.1 抗體特異性：除用抗原進(jìn)行抗體檢測(cè)，還應(yīng)用與

27、抗原成分相關(guān)的其他抗原進(jìn)行交叉實(shí)驗(yàn)，方法：ELISA等。9.2 單克隆抗體亞類(lèi)的鑒定 商品化試劑盒9.3 Western Blot 分析9.4 抗體的中和活性9.5 抗體的親和力9.6 抗體對(duì)應(yīng)抗原的分子量9.7 抗體的識(shí)別表位,10. 抗體純化,（1）初步純化鹽析法有機(jī)沉淀法凝膠過(guò)濾法（2）精細(xì)純化親和層析法離子交換層析法疏水層析法反向?qū)游龇?生物安全柜,II級(jí)A2型生物安全柜最常用,生物安全水

28、平與實(shí)驗(yàn)室類(lèi)型,世界通用生物安全水平標(biāo)準(zhǔn)是由美國(guó)疾病控制中心(CDC)和美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)建立的。,Ⅱ級(jí)生物安全柜是一種負(fù)壓過(guò)濾排風(fēng)柜。 防止操作者和環(huán)境暴露于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的生物氣溶膠。（1）保護(hù)實(shí)驗(yàn)操作者在操作時(shí)，室內(nèi)空氣被抽入前面的格柵，產(chǎn)生一個(gè)空氣屏障，防止有生物危險(xiǎn)的懸浮微粒散入室內(nèi)。（2）保護(hù)實(shí)驗(yàn)樣品層流的、HEPA過(guò)濾的空氣向下，通過(guò)工作面，防止室內(nèi)空氣進(jìn)入，防止樣品存在交叉污染。（3）保護(hù)實(shí)驗(yàn)室

29、環(huán)境在空氣離開(kāi)柜前，必須通過(guò)一個(gè)排氣HEPA濾膜，確保排出柜體的氣流是潔凈的，對(duì)環(huán)境無(wú)害。,細(xì)胞培養(yǎng)箱,倒置顯微鏡,含血清的DMEM,96孔細(xì)胞板,48孔細(xì)胞板,24孔細(xì)胞板,6孔細(xì)胞板,1. 為什么免疫后沒(méi)有效價(jià)或免疫后效價(jià)低？,（1） 設(shè)計(jì)的抗原與被免疫的動(dòng)物內(nèi)源蛋白有極高的同源性或者抗原是免疫原性極差的小分子物質(zhì)。對(duì)于前一種情況應(yīng)該重新設(shè)計(jì)抗原，設(shè)計(jì)抗原時(shí)盡量選取目標(biāo)蛋白特異性的序列，可以設(shè)計(jì)為短肽然后再與載體蛋白偶聯(lián)之后免

30、疫；對(duì)于后一種情況，首先確認(rèn)抗原質(zhì)量是否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號(hào)，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu)，或改進(jìn)提取方法；制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯(lián)劑、載體、抗原與載體的連接比例、 反應(yīng)時(shí)間等多方面去考慮，并加以改進(jìn)；如果偶聯(lián)沒(méi)有問(wèn)題，可以更換其它的載體蛋白，如 KLH 。,（2） 免疫的周期不正確。免疫周期過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短，各免疫步驟之間的間隔過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都有可能影響免疫效果。,（3）免疫佐劑不合適。弗氏佐劑也不能

31、保證完全有效，TiterMax 等佐劑在免疫時(shí)，對(duì)于某些抗原可能效果不佳，此時(shí)可以考慮更換佐劑嘗試。,（4）免疫劑量不合理。過(guò)大的免疫劑量可能導(dǎo)致免疫耐受，過(guò)少的免疫劑量可能無(wú)法激活免疫應(yīng)答。,（5）免疫途徑不合理。,（6） 測(cè)效價(jià)的過(guò)程存在錯(cuò)誤操作，尤其考慮包被是否成功或二抗使用是否正確。同時(shí)，一抗（即血清）稀釋梯度盡量放寬，一般建議從1:500或1:1000開(kāi)始作梯度稀釋。對(duì)于多肽和小分子物質(zhì)，效價(jià)達(dá)到1:2000甚至更低仍可視為免

32、疫成功。,（7）動(dòng)物的飼養(yǎng)是否得當(dāng)，如營(yíng)養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風(fēng)、采光、溫度）是否符合要求，動(dòng)物的健康情況是否良好等。,2. 為什么融合后細(xì)胞不長(zhǎng)或者融合后克隆很少？ （1）免疫用的動(dòng)物品系不正確或者品系不純。免疫用的動(dòng)物一般應(yīng)該與骨髓瘤來(lái)源的動(dòng)物是相同品系，例如使用 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞時(shí)應(yīng)該選用 Balb/C 小鼠，同時(shí)必須使用品系純正的小鼠。（2）培養(yǎng)基中加入了過(guò)高濃度的 HAT，或者僅 A 的濃度過(guò)高或 HT 的濃

33、度過(guò)低，建議用純的骨髓瘤和已有的雜交瘤作 HAT 濃度篩選。（3）培養(yǎng)基不正確或血清濃度不正確或使用了劣質(zhì)血清。（4）未正確制備飼養(yǎng)細(xì)胞。（5）接種雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)板過(guò)多。一般在5-20塊96孔板為宜。,（6） 細(xì)胞被污染。在顯微鏡下仔細(xì)觀察是否有明顯的微生物污染。即使看不到有明顯的微生物，也應(yīng)該考慮是否有支原體污染，有條件的可以做支原體檢測(cè)。（7） 細(xì)胞培養(yǎng)條件不正確。確保細(xì)胞培養(yǎng)在恒定的37℃較濕的環(huán)境，同時(shí)保證 CO2濃度

34、在4-5%左右。（8）其它與融合條件相關(guān)的不恰當(dāng)?shù)囊蛩亍?3. 為什么融合后得不到陽(yáng)性克??？ （1）動(dòng)物未免疫成功就進(jìn)行了融合。 （2） 融合后得到的克隆較少，故得到陽(yáng)性克隆的機(jī)率也較小。 （3）篩選克隆手段不正確。例如有些小分子物質(zhì)不可以直接包被到酶標(biāo)板上，再如使用了不適當(dāng)?shù)亩沟戎T多因素，也有人直接不使用 ELISA 作為篩選方法的，成功率也有待商榷。（4）抗原成份與細(xì)胞培養(yǎng)條件中的物質(zhì)相同或類(lèi)似，或者與篩選過(guò)程中有同抗

35、 原結(jié)構(gòu)相同或類(lèi)似的物質(zhì)產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。如果需要制備抗 BSA 的單抗，則養(yǎng)雜交瘤的培養(yǎng)基中不可以使用牛血清，否則牛血清中的 BSA 直接與抗體相結(jié)合，最后做 ELISA 篩選的時(shí)候無(wú)法得到陽(yáng)性結(jié)果。解決的辦法只有使用其它的動(dòng)物的血清或者使用無(wú)血清培養(yǎng)基。再如，如果需要制備酪蛋白的單抗，則做 ELISA 篩選時(shí)，二抗的稀釋液不可以使用脫脂奶粉。（5） 其它所有能影響 ELISA 等相關(guān)篩選手段的因素。,4 . 為什么細(xì)胞生長(zhǎng)很慢？

36、（1）使用了劣質(zhì)的培養(yǎng)耗材、培養(yǎng)基、血清、HAT 或 HT。建議新手使用知名廠商的試劑或耗材。對(duì)于血清，可能需要從多個(gè)廠家選用多個(gè)批次試用，選擇出比較好的批次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在試用血清的時(shí)候，一般可以使用相對(duì)較低濃度的血清進(jìn)行骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)骨髓瘤細(xì)胞的倍增速度確實(shí)血清質(zhì)量。（2）使用的血清或培養(yǎng)基濃度不正確。仔細(xì)檢查配方是否正確。（3）制備飼養(yǎng)細(xì)胞的方法不正確。,5. 克隆原來(lái)檢測(cè)是陽(yáng)性的，為什么后來(lái)轉(zhuǎn)為陰性了？ 首先要注

37、意的是，正常情況下，雜交瘤也不是絕對(duì)穩(wěn)定的，確實(shí)容易發(fā)生染色體丟失的情況，尤其是當(dāng)細(xì)胞移到新環(huán)境中生長(zhǎng)，如從小孔擴(kuò)大到大孔，或者復(fù)蘇操作時(shí)，更容易發(fā)生陽(yáng)性變?yōu)殛幮浴５且灿幸恍┺k法盡量減少陽(yáng)性變?yōu)殛幮?，一般可以從這幾個(gè)方面加以注意：（1）永遠(yuǎn)保證細(xì)胞處在最佳的生長(zhǎng)環(huán)境中。尤其是培養(yǎng)基不能長(zhǎng)期不換，一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)細(xì)胞增長(zhǎng)到一定密度的時(shí)候，培養(yǎng)基就開(kāi)始變顏色，這個(gè)時(shí)候就要準(zhǔn)備換培養(yǎng)基了。除了換培養(yǎng)基，同時(shí)應(yīng)該控制好細(xì)胞的密度，可以吹走過(guò)多

38、的細(xì)胞，使新加入的培養(yǎng)基不至于很快被消耗。（2）對(duì)于重要的細(xì)胞株，每一步都把陽(yáng)性的細(xì)胞保種。（3）不要過(guò)于頻繁操作細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度不是很大的時(shí)候，不要頻繁操作，否則細(xì)胞容易出現(xiàn)死亡或者生長(zhǎng)形態(tài)發(fā)生明顯變化。,（4） 對(duì)于傳代次數(shù)較多的細(xì)胞株需要經(jīng)常進(jìn)行亞克隆，并將每一次的亞克隆株也作凍存。（5）當(dāng)細(xì)胞被支原體等微生物污染，也會(huì)發(fā)生由陽(yáng)性轉(zhuǎn)為陰性的情況。,6. 為什么亞克隆后長(zhǎng)不出克隆來(lái)？（1）亞克隆時(shí)，原始孔里的細(xì)胞狀態(tài)不好

39、，經(jīng)過(guò)有限稀釋或其它手段亞克隆的細(xì)胞活性很差，以至于長(zhǎng)不出克隆。（2）亞克隆時(shí)，沒(méi)有按照正確的數(shù)量取出細(xì)胞，亞克隆的過(guò)程服從泊松分布，如果取出的細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于平均每孔一個(gè)細(xì)胞，或有效細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于平均每孔一個(gè)細(xì)胞，則也可能出現(xiàn)長(zhǎng)不出克隆的結(jié)果。（3）未添加飼養(yǎng)細(xì)胞。單個(gè)細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中極難培養(yǎng)，如果不添加飼養(yǎng)細(xì)胞，則它們很可能很快就死亡，最終就長(zhǎng)不出克隆。,（4） 使用的 HAT 中 HT 失效或 A 的濃度過(guò)高，或者未添加 HT。

40、雖然 HT 對(duì)雜交瘤的生長(zhǎng)并不是必須的，但是 HT 確實(shí)可以加快細(xì)胞生長(zhǎng)，改善細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。 （5）使用無(wú)血清培養(yǎng)基。這一點(diǎn)是很冷僻的一個(gè)因素。雖然很少有人使用無(wú)血清培養(yǎng)基制備單抗，但是在某些血清可能干預(yù)篩選步驟的實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，可能會(huì)選用無(wú)血清培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)雜交瘤，但是需要注意的是，在很多種無(wú)血清培養(yǎng)基中，單個(gè)細(xì)胞是很難長(zhǎng)成克隆的。最好的解決辦法就是先用含有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)它們，等克隆長(zhǎng)出后再把培養(yǎng)基徹底更換為無(wú)血清培養(yǎng)基。,7.

41、 為什么凍存的細(xì)胞很難復(fù)蘇或者復(fù)蘇不活？這個(gè)問(wèn)題要從兩個(gè)方面來(lái)回答，一是凍存方面，二是復(fù)蘇問(wèn)題。7.1 對(duì)于凍存過(guò)程，需要注意：（1） 凍存液的配方。這個(gè)問(wèn)題很關(guān)鍵，一個(gè)良好的凍存液配方可以使細(xì)胞保存得非常好，而一個(gè)不好的凍存液配方可能會(huì)讓細(xì)胞傾刻死亡。凍存保護(hù)劑 DMSO的含量非常重要，如果這個(gè)濃度過(guò)低，則起不到保護(hù)作用，凍存的細(xì)胞最終會(huì)死于冰晶形成時(shí)的張力，如果濃度過(guò)高，則細(xì)胞中毒而亡。,（2）凍存過(guò)程中，不可用力過(guò)大，在凍

42、存液中重懸細(xì)胞的時(shí)候更是要輕柔，因?yàn)樵?DMSO 存在的條件下，細(xì)胞膜變得非常脆弱，如果用力過(guò)猛，則細(xì)胞膜很容易破，復(fù)蘇成活的機(jī)會(huì)就明顯會(huì)下降。（3）凍存的程序也非常重要。實(shí)踐表明，以每分鐘1℃的速度下降凍存細(xì)胞是最理想的。,（5） 保證被凍存的細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，并且沒(méi)有被污染。,（4）如果條件簡(jiǎn)易，可以把細(xì)胞放在4℃半小時(shí)左右，然后再在-20℃放置1小時(shí)，最后轉(zhuǎn)入-80℃放置過(guò)夜，最終轉(zhuǎn)入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80

43、℃也行?，F(xiàn)在有細(xì)胞凍存盒，把需要存放的細(xì)胞放進(jìn)去，然后直接放-80℃就行，等時(shí)間夠長(zhǎng)后直接轉(zhuǎn)至液氮中即可。,7.2 對(duì)于復(fù)蘇過(guò)程，需要注意：（1）快速融化。為了防止升溫中細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶，強(qiáng)烈建議加快融化過(guò)程。一般都要用足夠體積的 37℃熱水復(fù)蘇，并不斷晃動(dòng)凍存管。（2） 復(fù)蘇過(guò)程不要把凍存管全部泡入水中，也不要把蓋子弄濕，否則熱水有可能污染管口，造成復(fù)蘇的細(xì)胞被污染。（3） 如果復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)，沒(méi)有去掉凍存液，這樣就把凍存液里的DM

44、SO 帶到了新的培養(yǎng)體系里，容易對(duì)細(xì)胞造成毒害，所以對(duì)于貼壁細(xì)胞貼壁后換液或者細(xì)胞離心后去掉凍存液，然后用新的完全培養(yǎng)基重懸，再接種到新的容器內(nèi)培養(yǎng)。,8. 單克隆抗體制備細(xì)胞實(shí)驗(yàn)最棘手的問(wèn)題-細(xì)胞污染,細(xì)胞培養(yǎng)污染是指培養(yǎng)環(huán)境中侵入了對(duì)細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞變異的異物。細(xì)胞培養(yǎng)污染可分為以下三類(lèi): 物理性、化學(xué)性及生物性。,8.1 物理性污染的來(lái)源、危害及預(yù)防 物理性污染通過(guò)影響細(xì)胞培養(yǎng)體系中的生化成分, 從而影響細(xì)

45、胞的代謝。（1）培養(yǎng)環(huán)境中的物理因素，如溫度、放射線、振動(dòng)、輻射( 紫外線或熒光) 會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。（2）細(xì)胞、培養(yǎng)液或其它培養(yǎng)試劑暴露于放射線、輻射或過(guò)冷過(guò)熱的溫度中， 可以引起細(xì)胞代謝發(fā)生改變, 如細(xì)胞同步化、細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制甚至細(xì)胞死亡。,（3）防范措施：通過(guò)實(shí)驗(yàn)室的合理設(shè)計(jì)及建立規(guī)范的操作規(guī)程， 可以減少環(huán)境中物理因素對(duì)細(xì)胞的影響。培養(yǎng)箱應(yīng)放在溫度較恒定的環(huán)境中，周?chē)荒芊胖媚芤饳C(jī)械振動(dòng)的設(shè)備，如離心機(jī)。培養(yǎng)液及培養(yǎng)試劑應(yīng)

46、放在固定的位置，為避免光照試劑不能放在玻璃門(mén)的冰箱中，試劑周?chē)荒芊磐凰?。培養(yǎng)液從冰箱中取出后應(yīng)在室溫中放置一段時(shí)間后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以避免過(guò)冷的溫度對(duì)細(xì)胞的影響。,8.2 化學(xué)性污染的來(lái)源、危害及預(yù)防 培養(yǎng)環(huán)境中許多化學(xué)物質(zhì)都可以引起細(xì)胞的污染?；瘜W(xué)物質(zhì)并不總是抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)， 某些化學(xué)物質(zhì)如激素就可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。不同細(xì)胞對(duì)化學(xué)物質(zhì)污染的反應(yīng)是不一樣的。 未純化的物質(zhì)、試劑、水、血清、生長(zhǎng)輔助因

47、子及儲(chǔ)存試劑的容器都可能成為化學(xué)性污染的來(lái)源。 細(xì)胞培養(yǎng)的必需養(yǎng)分，如氨基酸，若濃度超過(guò)了合適的范圍，也會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。同樣，不同細(xì)胞系其最佳培養(yǎng)條件下對(duì)血清和緩沖液的要求是不一樣的，在培養(yǎng)中應(yīng)嚴(yán)格控制。 玻璃制品清洗過(guò)程中殘留的變性劑或肥皂( 通常殘留在瓶蓋的內(nèi)表面) 是最常見(jiàn)的化學(xué)性污染。,8.2.1 水 水是唯一一種在凝固時(shí)膨脹的化合物。因此在選擇凍存細(xì)胞的容器時(shí)應(yīng)考慮到這個(gè)因素。

48、容器因水的膨脹而發(fā)生破裂是引起試劑污染的重要原因。為了避免金屬離子、有機(jī)分子、細(xì)胞內(nèi)毒素等物質(zhì)對(duì)水的污染，在配制液體，清洗容器時(shí)必須使用不含雜質(zhì)的超純水。需要注意的是, 超純水放置過(guò)久其純度會(huì)下降。 在高壓蒸氣滅菌及蒸餾水時(shí)水經(jīng)常被污染， 因?yàn)楦邏赫魵忮伡凹兯畽C(jī)的常規(guī)維護(hù)后可能有少量的化學(xué)物質(zhì)殘留。為了保證水的純度, 我們應(yīng)采取措施盡量避免化學(xué)物質(zhì)的殘留。,8.2.2 血清 動(dòng)物血清是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的天

49、然培養(yǎng)基, 但血清又是潛在的生物及化學(xué)污染的來(lái)源。 由于血清采集于多個(gè)動(dòng)物, 而且不同廠商的生產(chǎn)工藝及質(zhì)量各不相同, 因此血清中許多成分的濃度存在很大的變異。血清對(duì)不同細(xì)胞的促生長(zhǎng)能力及毒副作用取決于這些細(xì)胞的分化功能、組織來(lái)源及培養(yǎng)基的成分等因素。在進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)時(shí), 為了保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性, 最好選用同一批次的血清。,8.3.3 培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑 培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑

50、都可能成為化學(xué)性污染的來(lái)源。細(xì)胞培養(yǎng)使用的所有物質(zhì)都應(yīng)是高純度的，并經(jīng)過(guò)權(quán)威機(jī)構(gòu)的鑒定，實(shí)驗(yàn)者本人也應(yīng)對(duì)上述成分進(jìn)行純度鑒定。同時(shí), 正確配置和儲(chǔ)存培養(yǎng)液及試劑也非常重要的, 應(yīng)該采取標(biāo)準(zhǔn)的操作步驟，避免液體體積計(jì)算錯(cuò)誤, 混用類(lèi)似化合物等錯(cuò)誤。,8.3.4 培養(yǎng)器皿及容器 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)使用到各種不同的培養(yǎng)器皿及容器。培養(yǎng)器皿的大小,構(gòu)形設(shè)計(jì)可能會(huì)影響到培養(yǎng)中氣體交換、濕度、培養(yǎng)液的 pH 值和細(xì)胞生長(zhǎng)密度。培

51、養(yǎng)器皿的工藝及滅菌過(guò)程中的差異可能對(duì)培養(yǎng)體系產(chǎn)生影響。塑料制品在生產(chǎn)過(guò)程中可能殘留一些有毒成形劑，生產(chǎn)工藝的不同可能引起器皿表面附著能力的不同。儲(chǔ)存不同物質(zhì)時(shí)應(yīng)選用合適的塑料或玻璃容器，因?yàn)榫凭?、?qiáng)酸、強(qiáng)堿能夠溶解塑料或玻璃的某些成分。,8.3 生物性污染的來(lái)源、危害及預(yù)防 外界的微生物如昆蟲(chóng)、節(jié)肢動(dòng)物、原蟲(chóng)、霉菌、病毒、細(xì)菌、無(wú)細(xì)胞壁的微生物( 通常指支原體) 和其它類(lèi)型的細(xì)胞都可能侵入培養(yǎng)環(huán)境引起污染。只要在一

52、個(gè)開(kāi)放的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng), 都難以避免發(fā)生污染。,8.3.1 細(xì)菌污染􀂾細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素(一般為預(yù)防劑量)，也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴?。最常?jiàn)的有革蘭氏陽(yáng)性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見(jiàn)。􀂾培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無(wú)多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污

53、染。所以，每天應(yīng)仔細(xì)觀察。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成試驗(yàn)失敗和細(xì)胞株(系)丟失。,8.3.2 真菌污染􀂾真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中最常見(jiàn)的一種，尤其在霉雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易污染。最常見(jiàn)的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。􀂾培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見(jiàn)培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長(zhǎng)，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見(jiàn)

54、絲狀、管狀或樹(shù)枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間。個(gè)體細(xì)小，有增多趨勢(shì)。鏡下看時(shí)，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長(zhǎng)的菌絲相混淆。真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但最后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。,8.3.3 支原體污染􀂾支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的最小微生物，最小直徑0.2μm，一般過(guò)濾除菌無(wú)法去除它，光鏡下

55、難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開(kāi)始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件(pH7.6～8.0)下生存，對(duì)青霉素有抗藥性，多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。電鏡下可見(jiàn)其有三層結(jié)構(gòu)，無(wú)細(xì)胞壁，中央有電子密度大的密集顆粒或絲狀的中心囊。􀂾培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無(wú)明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。,8.3.4 病毒污染􀂾采用組織

56、細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)疫苗，如果沒(méi)有除去潛在病毒的組織培養(yǎng)物，會(huì)產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。若二倍體細(xì)胞系有SV40或多發(fā)瘤病毒，B淋巴細(xì)胞含EB病毒，細(xì)胞和會(huì)發(fā)生變異、轉(zhuǎn)化，形成異倍體的細(xì)胞系。因此潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。,8.3.5 非同種細(xì)胞污染􀂾由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材

57、和溶液沒(méi)有嚴(yán)格分開(kāi)，操作不當(dāng)，往往會(huì)使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。如“靈長(zhǎng)類(lèi)”細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)猴和鼠類(lèi)細(xì)胞的混合物，ERK/KD細(xì)胞是從兔腎中分離出來(lái)的，而現(xiàn)在句卻認(rèn)為是HeLa細(xì)胞。目前，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染，致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無(wú)效。􀂾非細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。,預(yù)防措施：（1）在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)，所用器具要

58、嚴(yán)格區(qū)分，最好做上標(biāo)記便 于辨別。并按順序進(jìn)行操作，避免一起進(jìn)行時(shí)易發(fā)生混亂。（2）在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí)，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口，以 免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞。（3）所有細(xì)胞一旦購(gòu)置，或從別處引入，或自己建立，均應(yīng)及早留種凍存，一 旦發(fā)生污染可棄之復(fù)蘇，重新培養(yǎng)。,9.　單克隆抗體面臨的問(wèn)題,9.1 如何進(jìn)一步縮短單抗研發(fā)周期,降低生產(chǎn)成本,傳統(tǒng)方法制備單克隆抗體包括抗原制備、動(dòng)物免疫

59、、抗體檢測(cè)方法的建立、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選、亞克隆、凍存復(fù)蘇、雜交瘤細(xì)胞及單克隆抗體特性的鑒定及單克隆抗體的大量生產(chǎn)等一系列復(fù)雜步驟，一般要花費(fèi)6個(gè)月以上的時(shí)間，研發(fā)周期較長(zhǎng)。同時(shí)每只小鼠自始自終只能免疫一種純化抗原，將這種免疫小鼠的脾臟B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合后，形成的雜交瘤細(xì)胞也只能分泌針對(duì)這一種純化抗原的單一單克隆抗體，工作效率低,生產(chǎn)成本高。因此，如何利用分子生物學(xué)技術(shù)，克服現(xiàn)有生產(chǎn)技術(shù)的局限性,縮短單抗研發(fā)周期，降

60、低生產(chǎn)成本，建立生產(chǎn)雜交瘤細(xì)胞株的高效方法，是當(dāng)前需 解決的問(wèn)題。,9.2 如何進(jìn)一步提高體外用單抗的品質(zhì),研制高親和性單抗是免疫化學(xué)技術(shù)的重要發(fā)展方向之一，將會(huì)進(jìn)一步提高單克隆抗體在微量分析領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用。同時(shí)，隨著單抗在診斷與治療中應(yīng)用的快速發(fā)展，對(duì)單抗種類(lèi)及數(shù)量的需求越來(lái)越多,如何進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)也已成為抗體純化的主要問(wèn)題。另外，單克隆抗體對(duì)抗原的識(shí)別,與多克隆抗體有很大的不同。不同試劑盒因使用的單克隆抗體不同,識(shí)別抗原的位點(diǎn)不同

61、，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果有一定差異。因此,體外用單抗標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題還需要進(jìn)一步研究。,9.3 如何進(jìn)一步提高治療用單抗的品質(zhì),如何進(jìn)一步降低單抗藥物的免疫原性，提高單抗藥物在腫瘤組織的濃度是研制治療用單抗的發(fā)展方向。,一、鼠源性單克隆抗體,發(fā)展歷程,二、人源化抗體,1. 概念：是指抗體的可變區(qū)部分（即Vh和Vl區(qū)）或抗體所有全部由人類(lèi)抗體基因所編碼。,2. 人源化抗體包括嵌合抗體、改型抗體、表面重塑 抗體和全人源化抗體等。,2.1 嵌合抗體（1）

62、概念：是利用DNA重組技術(shù)，將異源單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)出嵌合抗體，這樣表達(dá)的抗體分子中輕重鏈的V區(qū)是異源的，而C區(qū)是人源的，這樣整個(gè)抗體分子的近2/3部分都是人源的。,（2）特點(diǎn)：減少了鼠源性抗體的免疫原性；保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。,2.2 改型抗體（1）概念：改型抗體也稱CDR植入抗體(CDR grafting antibody)，抗體可變區(qū)的CDR是抗體識(shí)別和

63、結(jié)合抗原的區(qū)域，直接決定抗體的特異性。將鼠源單抗的CDR移植至人源抗體可變區(qū)，替代人源抗體CDR，使人源抗體獲得鼠源單抗的抗原結(jié)合特異性，同時(shí)減少其異源性。,2.3 表面重塑抗體,（1）概念：表面重塑抗體是指對(duì)異源抗體表面氨基酸殘基進(jìn)行人源化改造。該方法的原則是僅替換與人抗體SAR差別明顯的區(qū)域，在維持抗體活性并兼顧減少異源性基礎(chǔ)上選用與人抗體表面殘基相似的氨基酸替換。,2.4 全人源化抗體,（1）概念：是指將人類(lèi)抗體基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因

64、或轉(zhuǎn)染色體技術(shù)，將人類(lèi)編碼抗體的基因全部轉(zhuǎn)移至基因工程改造的抗體基因缺失動(dòng)物中，使動(dòng)物表達(dá)人類(lèi)抗體，達(dá)到抗體全人源化的目的。,三 、小分子抗體,完整抗體分子具有體積大（相對(duì)分子質(zhì)量約為150×103）、組織穿透能力差等不足，促進(jìn)了抗體分子的小型化。小分子抗體具有組織穿透能力強(qiáng)、免疫原性弱、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、制備簡(jiǎn)單和表達(dá)效率高等優(yōu)點(diǎn)，是基因工程中制備人源單抗的主要產(chǎn)物，目前小分子抗體主要用于放射免疫顯像或治療等方面。其缺點(diǎn)是與抗原的結(jié)

65、合力弱、半衰期短等。 小分子抗體主要包括：①單價(jià)小分子抗體，如Fab 片段、Fv 片段最小識(shí)別單位等；②多價(jià)小分子抗體，如雙鏈、三鏈抗體等；③納米抗體，即只有一個(gè)重鏈可變區(qū)組成的單域抗體，其相對(duì)分子質(zhì)量只有單克隆抗體的1/10，是最小的具有完整功能的抗原結(jié)合片段。,單克隆抗體被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)及其他生物領(lǐng)域，并發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。,1.　檢測(cè)微生物,1.1　檢測(cè)特異的病毒,單克隆抗體具有高靈敏性和高特異性,在鑒定菌

66、種和病毒等的群特異性、種特異性、型和亞型特異性,乃至株特異性方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì),且能鑒定寄生蟲(chóng)不同生活周期的抗原性,常用于疫病檢疫、診斷、免疫監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查等。,（1）植物病毒單克隆抗體的研制主要應(yīng)用于植物病毒和病害檢測(cè)及株系鑒別。,（2）在動(dòng)物病毒單克隆抗體的研制方面，用于疫病診斷。,1.2　鑒定細(xì)菌種類(lèi)及亞型, 或測(cè)其耐藥性,1.3 檢測(cè)寄生蟲(chóng)或其他病原體,馮秀麗等(2007)用提取的禽致病性大腸桿菌1型菌毛免疫BALB/c小

67、鼠制備單克隆抗體,對(duì)46株帶有1型菌毛的禽致病性大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型分離株進(jìn)行檢測(cè)表明，該單克隆抗體都能與之發(fā)生特異性反應(yīng)。王崇義等(2006)用單克隆抗體標(biāo)記乳膠凝集試驗(yàn)快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌及其耐藥性，具有較高靈敏度和特異性。,陳心春等(2007) 將人隱孢子蟲(chóng)超粉碎后,免疫BALB/c小鼠制備單克隆抗體，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其反應(yīng)性表明，該單抗對(duì)隱孢子蟲(chóng)胞內(nèi)和胞外的檢測(cè)無(wú)差異。孫曉林等(2008)將純化的豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴45W-4BX重

68、組抗原免疫BALB/c小鼠制備單克隆抗體，結(jié)果表明所獲單抗能滿足常規(guī)試驗(yàn)的要求，可用于帶絳蟲(chóng)六鉤蚴45W-4BX抗原的組織定位。,2.1 檢測(cè)機(jī)體內(nèi)微量成分,如 檢測(cè) γ-干擾素,2.2　檢測(cè)藥物殘留,3. 確定免疫機(jī)制,分析抗原結(jié)構(gòu),定位病原組織,單克隆抗體由于其與抗原結(jié)合的特異性及檢測(cè)過(guò)程中逐級(jí)放大的特點(diǎn)，可以精確定位和定量抗原,是免疫學(xué)和血清學(xué)研究的重要工具,被廣泛用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ ELISA）、流式活化細(xì)胞分選儀(F

69、CS)、免疫印跡和免疫組化研究中，其靈敏度可達(dá)到微克(μg)水平，可利用它更全面、更細(xì)微地分析抗原結(jié)構(gòu),特別是分析細(xì)胞表面的小分子抗原，對(duì)分析體內(nèi)免疫反應(yīng)機(jī)制、判斷機(jī)體免疫水平和免疫調(diào)節(jié)平衡狀態(tài)具有重要的實(shí)際意義。,4.　在腫瘤診療中的應(yīng)用,（1）在醫(yī)學(xué)診斷方面,單克隆抗體可用于腫瘤的診斷、分型和定位；可區(qū)分不同細(xì)胞的亞群和分化階段，了解細(xì)胞的來(lái)源、分布和功能，以制定有效的治療方案；可用于主要組織相容性抗原HLA系統(tǒng)的分型和ABO等血型