2017分子病理檢測原位雜交技術(shù)平臺

1、分子病理檢測平臺 ------原位雜交,病理科張朋新2017年3月8日,原位雜交原理及實(shí)驗(yàn)過程原位雜交的應(yīng)用1.EBER2.HPV3. Kappa和Lamda熒光原位雜交的原理及探針類型熒光原位雜交的應(yīng)用1.實(shí)體性腫瘤2. 淋巴造血系統(tǒng)腫瘤3. 產(chǎn)前診斷,,原位雜交原理,核酸分子雜交（nucleic acid hybirdzation）：指具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基互

2、補(bǔ)配對原則形成雙鏈的過程。雜交雙方分別為待檢的核酸序列和已知的核酸序列，后者常用核素和非核素示蹤標(biāo)記，稱為探針（probe），雜交后形成異源性雙鏈分子稱為雜交體。生命科學(xué)的“釣魚” 。,,,DNA,,,制片,,,,原位雜交原理及實(shí)驗(yàn)過程原位雜交的應(yīng)用1.EBER2.HPV3. Kappa和Lamda熒光原位雜交的原理及探針類型熒光原位雜交的應(yīng)用1.實(shí)體性腫瘤2. 淋巴造血系統(tǒng)腫瘤3. 產(chǎn)前診斷,,普通原位雜交（ISH）

3、,用途： 檢測DNA及RNA表達(dá)的情況，輔助病學(xué)學(xué)診斷檢測項(xiàng)目：1. EBV病原EBER原位雜交檢測2. HPV病原體低危6/11和高危16/18原位雜交檢測3. Kappa和lambda克隆性分析原位雜交法檢測檢測結(jié)果分析：僅為細(xì)胞核著色。只有當(dāng)核分裂時可以出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)陽性著色。,,1、EBER檢測：潛伏性 EBV感染與幾種情況相關(guān)：鼻咽癌、淋巴組織疾?。ɑ羝娼鹆馨土觥?Burkitt淋巴瘤、 NK/T細(xì)胞淋巴瘤、血管免疫

4、母細(xì)胞淋巴瘤、腸病T細(xì)胞淋巴瘤、免疫抑制劑患者淋巴瘤、淋巴樣肉芽腫、傳染性單核細(xì)胞增多癥等）。一旦感染EBV，受感染者終身帶病毒。EBV具有感染和轉(zhuǎn)化B細(xì)胞特性，能使小淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變成永生的類淋巴母細(xì)胞的特征。,,,2、HPV檢測：HPV感染與生殖器疣、宮頸癌相關(guān)（12個低危型、15個高危型）。HPV原位雜交檢測；低危HPV6/11、高危16/18型。,,3. Kappa 及Lambda檢測輕鏈限制性或者單克隆性可用于區(qū)分B細(xì)胞反應(yīng)

5、性增殖和腫瘤性增殖。,原位雜交原理及實(shí)驗(yàn)過程原位雜交的應(yīng)用1.EBER2.HPV3. Kappa和Lamda熒光原位雜交的原理及探針類型熒光原位雜交的應(yīng)用1.實(shí)體性腫瘤2. 淋巴造血系統(tǒng)腫瘤3. 產(chǎn)前診斷,,,,,,FISH探針種類,,FISH探針種類,,,,,,原位雜交原理及實(shí)驗(yàn)過程原位雜交的應(yīng)用1.EBER2.HPV3. Kappa和Lamda熒光原位雜交的原理及探針類型熒光原位雜交的應(yīng)用1.實(shí)體性腫

6、瘤2. 淋巴造血系統(tǒng)腫瘤3. 產(chǎn)前診斷,,熒光原位雜交（FISH）,原理：通過熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交用途：檢測基因異常1.基因片段擴(kuò)增 2.基因片段缺失 3.基因片段易位FISH技術(shù)的應(yīng)用：1.靶向藥物篩選 2.危險(xiǎn)人群篩查3.風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測分析 4.

7、輔助診斷,FISH檢測項(xiàng)目,1.實(shí)體性腫瘤Her-2基因檢測，指導(dǎo)Herceptin分子靶點(diǎn)的治療；EGFR基因擴(kuò)增檢測，指導(dǎo)肺癌、腸癌分子靶點(diǎn)治療；ALK基因易位檢測，指導(dǎo)肺癌分子靶點(diǎn)治療；檢測尿脫落細(xì)胞染色體非整倍性，用于膀胱癌的診斷、復(fù)發(fā)判斷；檢測宮頸癌腫瘤細(xì)胞TERC基因擴(kuò)增，判斷CIN病變的演進(jìn)風(fēng)險(xiǎn)等。2.淋巴造血系統(tǒng)疾病淋巴瘤診斷分型，檢測特異染色體易位，協(xié)助淋巴瘤分類；慢性粒細(xì)胞白血病等白血病及多發(fā)性骨髓瘤

8、FISH檢測，判斷預(yù)后等。3.產(chǎn)前診斷唐氏綜合癥（21三體）等產(chǎn)前染色體數(shù)目檢測，協(xié)助產(chǎn)前診斷。,計(jì)數(shù)細(xì)胞必須是各通道信號均清晰可辨的細(xì)胞，細(xì)胞核輪廓不清或有重疊的不要分析。雜交不均勻的區(qū)域不要分析。背景深影響信號判斷的區(qū)域不要分析。在分析石蠟切片時，分析的區(qū)域應(yīng)在腫瘤細(xì)胞集中的部位（需由病理科醫(yī)師認(rèn)定）如果超過25％的細(xì)胞核內(nèi)信號太弱，則該區(qū)域不要進(jìn)行分析。如果超過10％的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有信號，則該區(qū)域不要進(jìn)行分析。

9、,結(jié)果判讀、分析,FISH結(jié)果觀察流程,觀察程序：首先在HE染色切片上確認(rèn)癌細(xì)胞區(qū)域；然后在10×物鏡下，于FISH標(biāo)本上找到與HE染色切片上相同的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，仔細(xì)觀察信號；在40×物鏡下掃描整張切片，觀察是否存在表達(dá)的異質(zhì)性，以及標(biāo)本的質(zhì)量，滿意的標(biāo)本應(yīng)是75%以上癌細(xì)胞核中都有雜交信號；在100×物鏡下觀察癌細(xì)胞核的FISH結(jié)果并進(jìn)行信號計(jì)數(shù)和比值計(jì)算。,,實(shí)體腫瘤FISH應(yīng)用,,,1.

10、乳腺癌Her-2/neu基因擴(kuò)增檢測,,,,,,HER2/CEN-17 1.8-2.2 臨界需重新再進(jìn)行另外20個的細(xì)胞計(jì)數(shù)或重新FISH檢測，如仍不確定，則建議臨床結(jié)合IHC檢測HER2蛋白表達(dá)情況決定是否使用靶向治療。CEN-17多體性：計(jì)數(shù)20個細(xì)胞內(nèi)綠信號的均值。CEN-17均值3.76 高多體性,,,石蠟切片（ASCO/CAP 2013指南）,計(jì)數(shù)至少30個細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)Ratio值（Ratio值＝30個細(xì)

11、胞核中紅/綠）。 Ratio≥2.0或者＜2.0但HER-2信號數(shù)為≥6.0，結(jié)果為陽性，提示基因擴(kuò)增； Ratio＜2.0且HER-2信號數(shù)＜4.0為陰性結(jié)果，提示樣本無基因擴(kuò)增； Ratio＜2.0且4.0≤HER-2信號數(shù)＜6.0時結(jié)果為不確定，可以選擇增加計(jì)數(shù)細(xì)胞至100個,或重做FISH實(shí)驗(yàn)來判斷最終結(jié)果。若紅信號明顯成簇或成團(tuán)，判斷為擴(kuò)增。,乳腺癌HER-2 FISH評分標(biāo)準(zhǔn),,,,,,,,,,,,2.

12、胃癌Her-2/neu基因擴(kuò)增檢測,,,,胃癌HER-2 FISH評分標(biāo)準(zhǔn),胃癌HER-2檢測指南：計(jì)數(shù)至少30個細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)Ratio值（Ratio值＝30個細(xì)胞核中紅/綠）。 Ratio≥2.2或者HER-2信號簇狀，結(jié)果為陽性，提示基因擴(kuò)增； Ratio＜1.8為陰性結(jié)果，提示樣本無基因擴(kuò)增； Ratio在1.8-2.2時，選擇增加計(jì)數(shù)細(xì)胞至100個,若Ratio ≥ 2.0，判斷為陽性，若Ratio <

13、2.0，判斷為陰性。必要時重做FISH實(shí)驗(yàn)來判斷最終結(jié)果。,,3. 肺癌EML4-ALK基因融和檢測,,,肺癌EML4-ALK檢測指南：計(jì)數(shù)至少50個腫瘤細(xì)胞1.無ALK基因斷裂的腫瘤細(xì)胞中，橘紅色和綠色重疊為黃色或者相互粘合（兩個信號之間的間隔小于兩個信號的直徑）；2.在ALK基因斷裂的腫瘤細(xì)胞中，橘紅色和綠色分離（兩個信號之間的間隔大于兩個信號的直徑），如果50個肺癌細(xì)胞中至少有25個存在分離信號，則為ALK FISH陽性；

14、3.在ALK基因斷裂的腫瘤細(xì)胞中，橘紅色和綠色分離（兩個信號之間的間隔大于兩個信號的直徑），如果50個肺癌細(xì)胞中分離信號為5—25個，則需重復(fù)計(jì)數(shù)50個細(xì)胞，累計(jì)100個細(xì)胞中超過15個存在分離信號（〉=15%）則為ALK FISH陽性；,肺癌EML4-ALK FISH評分標(biāo)準(zhǔn),,,,,,4. 其他實(shí)體腫瘤FISH應(yīng)用,,1.TOP2A/CSP17 (乳腺癌)：指導(dǎo)化療藥物蒽環(huán)類應(yīng)用2. EGFR/CDP17(肺癌)：指導(dǎo)靶向藥物應(yīng)

15、用3.C-MET(肺癌)：指導(dǎo)靶向藥物的應(yīng)用4.TERC/CSP3 (宮頸癌)：判斷CIN病變的演進(jìn)風(fēng)險(xiǎn)分級，早診5. CSP3/CSP7 、P16/CSP17(膀胱癌)：膀胱癌的早診、復(fù)發(fā)判斷；6.PTEN/CEN10 、FGFR1/CEN8 、ERG（前列腺癌）：判斷預(yù)后、早診7.1p36/1p25 、19q13/19p13、N-Myc/2q11（神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤）：輔助診斷、判斷預(yù)后、指導(dǎo)化療方案應(yīng)用、8. P

16、TEN/CEN10（黑色素瘤）：指導(dǎo)藥物治療、判斷預(yù)后9. CCND1/CEN11、MDM2/CEN12（間質(zhì)瘤）：判斷預(yù)后10.SYT(滑膜肉瘤)：輔助診斷11.EWS(尤文肉瘤)：輔助診斷12.FKHR(橫紋肌肉瘤)：輔助診斷13.MDM2 (脂肪肉瘤)：輔助診斷,,,,,返回,,,,,,,返回,,,,,返回,,,,,返回,,,,,返回,,,,,,,返回,,,返回,,,返回,,,返回,,,返回,,血液病FISH應(yīng)用,目前常

17、見的淋巴瘤染色體易位檢測,IGH/BCL6 t(3;14)t(3;22) t（2；3）染色體易位-彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤IGH/BCL2 t(14;18)(q32;q21) 染色體易位-濾泡性淋巴瘤IGH/MYC t(8;14)(q24;q32) 染色體易位-Burkitt’s淋巴瘤IGH/CCND1 t(11;14)(q13;q32) 染色體易位-套細(xì)胞淋巴瘤API2/MALT1 t(11;18)(q21;q21) 染色體易位-