三草安前湯對(duì)慢性非細(xì)菌性前列腺炎模型大鼠il-1β、il-6及tnf rⅱ表達(dá)的影響

1、<p>　　三草安前湯對(duì)慢性非細(xì)菌性前列腺炎模型大鼠IL-1β、IL-6及TNF RⅡ表達(dá)的影響</p><p>　　作者：周青,熊偉,張國(guó)民,方圓,肖紅玉,龔秀英</p><p>　　【摘要】 目的 觀察三草安前湯對(duì)慢性非細(xì)菌性前列腺炎模型大鼠炎癥因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子受體Ⅱ(TNF RⅡ)基因和蛋白表達(dá)的影響,闡明中藥復(fù)

2、方治療慢性非細(xì)菌性前列腺炎的炎癥因子蛋白靶點(diǎn)。方法 將72只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為6組,每組12只,除正常組外,其余5組應(yīng)用大鼠前列腺蛋白提純液輔以免疫佐劑制備實(shí)驗(yàn)性慢性非細(xì)菌性前列腺炎大鼠模型,正常組、模型組予生理鹽水,西藥組予消炎痛,三草安前湯大、中、小劑量組分別予不同劑量的三草安前湯連續(xù)灌胃。30 d后處死,采用免疫組織化學(xué)、熒光定量RT-PCR等方法檢測(cè)炎癥因子 mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果 三草安前湯可顯著降低慢性非細(xì)菌

3、性前列腺炎模型大鼠炎癥因子IL-1β、IL-6的mRNA及蛋白表達(dá)水平(P＜0.01),且大、中劑量組作用優(yōu)于小劑量組(P＜0.05),大、中劑量組與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；三草安前湯各劑量組TNF RⅡ表達(dá)降低,未隨劑量增加出現(xiàn)明顯變化(P＞0.05)。結(jié)論 三草安前湯對(duì)慢性非細(xì)菌性前列腺炎模型大鼠異常的免疫功能有調(diào)節(jié)作用,降低炎癥因子表達(dá)</p><p>　　【關(guān)鍵詞】 三草安前湯；慢性

4、非細(xì)菌性前列腺炎；炎癥因子；動(dòng)物模型</p><p>　　Abstract： Objective To observe the effects of Sancaoanqian decoction on expression of cytokine IL-1β, IL-6 and TNF RⅡ in experimental autoimmune prostatitis rats, and explore the

5、 target protein of cytokine of Chinese herbal compound in treating chronic nonbacterial prostatitis. Methods Seventy-two male Wistar rats were divided randomly into six groups and 12 rats in each group. All groups were m

6、ade experimental autoimmune prostatitis rat model by injecting SC purified prostate protein with FCA </p><p>　　Key words：Sancaoanqian decoction；chronic autoimmune prostatitis；cytokine；animal model</p>

7、<p>　　慢性非細(xì)菌性前列腺炎(CAP)是男科臨床常見的難治性疾病之一,炎癥因子在CAP的發(fā)病過程中與炎癥的過程、轉(zhuǎn)歸相關(guān)。前期臨床觀察顯示,三草安前湯治療濕熱挾瘀型CAP取得滿意的臨床療效[1]。為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制,筆者從基因、蛋白水平考察了三草安前湯對(duì)CAP模型大鼠炎癥因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子受體Ⅱ(TNF RⅡ)基因表達(dá)的影響。</p><p

8、><b>　　1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p><b>　　1.1 動(dòng)物</b></p><p>　　健康雄性Wistar大鼠77只,3月齡,體重200～300 g,湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。</p><p><b>　　1.2 主要試劑</b></p><p

9、>　　免疫組化相關(guān)試劑：兔抗大鼠IL-1β單克隆抗體,兔抗大鼠IL-6單克隆抗體(Eptomics公司,美國(guó))；兔抗大鼠TNF Receptor Type Ⅱ單克隆抗體(Prosci公司,美國(guó))；SABC免疫組化試劑盒,DAB顯色試劑(武漢博士德)。實(shí)時(shí)定量熒光RT-PCR相關(guān)酶類及試劑：細(xì)胞總RNA提取試劑Trizol(Gibco公司,美國(guó)),焦碳酸二乙酯DEPC(Promega公司,美國(guó))；Olig(dT)15, dNTP混合

10、物(上海Sangon)；M-MuLV、RNA酶抑制劑(Promega公司,美國(guó))；SYBR Green Ⅰ熒光染料(羅氏公司,瑞士)。</p><p><b>　　1.3 主要儀器</b></p><p>　　DU640核酸及蛋白分析儀(Beckman公司,美國(guó))；721B型分光光度計(jì)(上海第三儀器廠)；7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 (ABI,美國(guó))；高速低溫離心機(jī)

11、(Beckman公司,美國(guó))；TY-80S脫色搖床(江蘇華峰儀器有限公司)；臺(tái)式離心機(jī)(Beckman公司,美國(guó))。</p><p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p><b>　　2.1 分組</b></p><p>　　77只雄性Wistar大鼠,其中5只用于前列腺蛋白提純液的制備,其余72只隨機(jī)分6

12、組,分別為正常對(duì)照組、模型組、西藥組及三草安前湯大、中、小劑量組(以下簡(jiǎn)稱“SCAQ大、中、小劑量組”),每組12只。</p><p>　　2.2 大鼠前列腺蛋白提純液的制備</p><p>　　參照文獻(xiàn)[2]方法。取實(shí)驗(yàn)大鼠5只,無菌條件下剝?nèi)∏傲邢俳M織,生理鹽水洗凈,加入含0.5% TritonX-100的生理鹽水溶液,冰浴勻漿,10 000 r/min離心30 min。吸上清,比濁

13、法測(cè)定蛋白濃度。臨用時(shí)用0.01 mol/L pH 7.4 PBS調(diào)節(jié)蛋白濃度至15 mg/mL。</p><p><b>　　2.3 模型制備</b></p><p>　　參照文獻(xiàn)[2]方法。大鼠乙醚麻醉,腹腔注射百白破疫苗0.5 mL,多點(diǎn)皮下注射大鼠前列腺蛋白提純液和FCA(1∶1混懸液)1 mL,正常對(duì)照組皮下注射生理鹽水,30 d重復(fù)注射1次。第60日時(shí)每

14、組處死2只,取前列腺病理檢查,驗(yàn)證造模是否成功。</p><p>　　2.4 藥物制備及給藥</p><p>　　三草安前湯由金錢草、益母草、白花蛇舌草、紅藤、虎杖、丹參、王不留行等藥物組成(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供)。藥物經(jīng)高壓濃縮煎藥機(jī)煎煮后過濾濃縮,根據(jù)人-大鼠體表面積換算系數(shù)確定大、中、小劑量組,分別為4.45、2.23、0.89 g/mL原藥材量,按1 mL/100 g體

15、重劑量灌胃。西藥組給藥消炎痛(山西云鵬制藥有限公司,批號(hào)H14020771),劑量參照說明書,臨用時(shí)將藥搗碎,生理鹽水溶解并稀釋成0.9 mg/mL,按1 mL/100 g體重劑量灌胃。造模60 d后各組開始給藥,模型組及正常對(duì)照組用生理鹽水灌胃。30 d時(shí)處死大鼠。</p><p><b>　　2.5 樣本取材</b></p><p>　　末次給藥后24 h處死大

16、鼠,剝離前列腺并稱重,1/3組織置DEPC水中漂洗3次,迅速入液氮保存待提取總RNA,其余2/3組織入甲醛固定,石蠟包埋切片,病理切片HE染色,免疫組織化學(xué)染色。</p><p>　　2.6 免疫組化檢測(cè)炎癥因子表達(dá)</p><p>　　根據(jù)SABC試劑盒操作說明書進(jìn)行。</p><p>　　2.7 前列腺組織總RNA的提取及cDNA的制備</p>

17、<p>　　根據(jù)Trizol RNA提取試劑盒說明書操作。</p><p><b>　　2.8 引物</b></p><p>　　采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的方法,IL-1β、IL-6、TNF RⅡ、18S rRNA PCR引物根據(jù)相關(guān)基因的大鼠cDNA序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。引物及探針均由上海生工生物工程公司合成。引物設(shè)計(jì)采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)。&l

18、t;/p><p>　　2.9 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)前列腺炎炎癥因子的基因表達(dá)</p><p>　　取反轉(zhuǎn)錄的cDNA 2 μL為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測(cè)炎癥因子基因表達(dá)。反應(yīng)體系：2×SYBR Green PCR minister 20 μL,上、下游引物各1 μL(0.25 μmol/L),去離子水16 μL。充分混勻后加入cDNA模板2 μL。PCR反應(yīng)條件：①95

19、℃ 10 min；②95 ℃變性15 s,58 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸30 s,40循環(huán)；③85 ℃檢測(cè)熒光。溶解曲線分析,95 ℃ 1 min,65 ℃ 1 min,以0.1 ℃/s的速度升高溫度至95 ℃,連續(xù)檢測(cè)熒光。擴(kuò)增結(jié)束后分析溶解曲線,在溶解曲線上具有(85±0.8)℃ Tm峰判斷為PCR擴(kuò)增的單一性。同時(shí)設(shè)無模板對(duì)照、無RT對(duì)照及陽性對(duì)照。目的基因mRNA定量：取一定量的cDNA模板,分別2、5、8、1

20、0倍稀釋,依次進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,以β- actin mRNA的模板量為參照,計(jì)算目的基因的相對(duì)模板數(shù)。</p><p><b>　　3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法</b></p><p>　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示,采用方差分析,組間比較用q檢驗(yàn)。全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。</p><p&g

21、t;<b>　　4 結(jié)果</b></p><p><b>　　4.1 一般情況</b></p><p>　　造模前每組大鼠12只,造模及灌胃過程中模型組死亡1只,SCAQ小劑量組死亡1只,60 d時(shí)為評(píng)估造模情況每組處死2只,最后剩余正常組10只,模型組9只,西藥對(duì)照組10只, SCAQ小劑量組9只, SCAQ中劑量組10只,SCAQ大劑量組

22、10只。所有動(dòng)物于給藥后30 d時(shí)處死。</p><p>　　4.2 各組大鼠前列腺組織白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6及腫瘤壞死因子受體Ⅱ蛋白表達(dá)</p><p>　　IL-1β的棕色的陽性反應(yīng)主要在前列腺腺泡上皮細(xì)胞的胞漿或間質(zhì),細(xì)胞核不染色,部分組織還可見陽性反應(yīng)的條索狀結(jié)構(gòu)；IL-6在正常前列腺組織中有少量表達(dá),主要表達(dá)細(xì)胞為腺腔內(nèi)上皮細(xì)胞；TNF RⅡ表達(dá)主要存在于腺體上皮細(xì)胞

23、胞膜上。結(jié)果見表1。表1 三草安前湯對(duì)CAP模型大鼠前列腺組織炎癥因子蛋白表達(dá)水平的影響(略)注：與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與正常組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01(下同)</p><p>　　4.3 各組大鼠前列腺組織白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6及腫瘤壞死因子受體ⅡmRNA表達(dá)(見表2)</p><p>　　運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析了三草安前湯治

24、療后CAP大鼠IL-1β、IL-6、TNF RⅡmRNA在前列腺組織中的表達(dá)。將樣品進(jìn)行系統(tǒng)稀釋擴(kuò)增后做標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定各基因和β-actin mRNA的相對(duì)表達(dá)量,在不同稀釋度的樣品中擴(kuò)增了目的基因的cDNA,在PCR反應(yīng)中,低濃度的cDNA導(dǎo)致熒光信號(hào)增長(zhǎng)較慢,每個(gè)反應(yīng)都使用β-actin作為內(nèi)對(duì)照。SCAQ各劑量組以及西藥組治療后IL-1β、IL-6、TNF RⅡ mRNA在模型大鼠前列腺組織中的表達(dá)情況見表2。表2 三草安前湯對(duì)

25、CAP模型大鼠前列腺組織炎癥因子mRNA表達(dá)水平的影響(略)</p><p><b>　　5 討論</b></p><p>　　有研究表明,CAP患者前列腺分泌物或精液中可出現(xiàn)某些炎癥因子水平變化[3-4]。本研究結(jié)果顯示,CAP模型大鼠存在炎癥因子IL-1β、IL-6、可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ(sTNF RⅡ)表達(dá)增高的現(xiàn)象,提示炎癥因子的參與是CAP發(fā)病的重要機(jī)

26、制之一。在表達(dá)陽性的炎癥因子中,IL-1β、IL-6可促進(jìn)炎癥細(xì)胞的聚集、活化和炎癥介質(zhì)的釋放[5-6]；sTNF RⅡ作為炎癥因子受體參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子釋放以及促炎因子、抗炎因子的平衡[7]；尤其TNF-α、IL-1β被認(rèn)為是慢性前列腺炎癥持續(xù)存在的標(biāo)志[8]。本研究中僅檢測(cè)到IL-1β增高而TNF-α不增高,根據(jù)檢測(cè)結(jié)果中IL-6、sTNF RⅡ表達(dá)增強(qiáng)的結(jié)果,推測(cè)可能原因一是TNF-α多參與急性炎癥反應(yīng)過程,或在炎癥程度較重的情況下

27、表達(dá)增高,而長(zhǎng)期的炎癥狀態(tài)下TNF-α并不增高；二是TNF-α可促進(jìn)IL-6的分泌,雖然二者可以協(xié)同加劇炎癥反應(yīng),但I(xiàn)L-6持續(xù)表達(dá)增高又可下調(diào)TNF-α的合成；三是炎癥因子的動(dòng)態(tài)平衡作用,可能與sTNF RⅡ表達(dá)增強(qiáng)可抑制TNF-α表達(dá)增加有關(guān)。</p><p>　　CAP屬中醫(yī)“精濁”范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其基本病機(jī)是濕熱瘀阻,治宜清熱利濕、活血化瘀。三草安前湯方中金錢草味甘、淡,氣微寒,歸腎、膀胱經(jīng),功能清熱利濕

28、,通淋消腫,為君藥。益母草味苦、辛,氣微寒,歸肝、心、膀胱經(jīng),有活血兼利水濕之功,為臣藥。王不留行味苦氣平,歸肝、胃經(jīng),善通利血脈,有活血通絡(luò)之功；白花蛇舌草味微苦,氣寒,清熱解毒、利濕散結(jié)；紅藤味苦、氣平,清熱解毒、活血止痛；虎杖味苦、氣寒,清熱解毒、活血祛瘀；丹參味苦、氣微寒,有活血化瘀作用,共為佐使。全方合用,共奏清熱利濕、活血化瘀之功。本研究結(jié)果顯示,三草安前湯可顯著降低炎癥因子IL-1β、IL-6的mRNA及蛋白表達(dá)水平；TN

29、F RⅡmRNA出現(xiàn)下調(diào),但sTNF RⅡ蛋白水平也同時(shí)出現(xiàn)下調(diào),sTNF RⅡ來源于細(xì)胞膜TNF RⅡ,并可通過競(jìng)爭(zhēng)TNF RⅡ發(fā)揮保護(hù)性作用,兩者均降低表明三草安前湯并不能直接參與TNF RⅡ或s TNF RⅡ的調(diào)控,而是治療后TNF-α水平降低,通過機(jī)體TNF-α、TNF R、sTNFR體系的反饋?zhàn)饔瞄g接導(dǎo)致TNF RⅡ表達(dá)的降低。由此可見,參與免疫調(diào)節(jié)是三草安前湯治療CAP的機(jī)理之一。</p><p>&

30、lt;b>　　【參考文獻(xiàn)】</b></p><p>　　[1] 袁軼峰.三草安前湯直腸滴注治療濕熱下注型慢性前列腺炎的臨床觀察[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2007,(1)：35－36.</p><p>　　[2] 陳 磊,夏衛(wèi)平,周智恒.自身免疫性前列腺炎對(duì)大鼠前列腺形態(tài)學(xué)與炎性基因表達(dá)的影響[J].中華男科學(xué)雜志,2007,13(5)：444－448.</p>&

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