鮸魚消化道微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))</p><p>　題 目：鮸魚消化道微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性</p><p>　學(xué) 院：</p><p>　學(xué)生姓名：</p><p>　專 業(yè)：生物技術(shù)</p><p>　班 級(jí)：</p><p>　指導(dǎo)教師：</p>

2、;<p>　起止日期：</p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　目錄..I</b></p><p>　　摘要…………………………………………………………………………………….I</p><p>　　AbstractII</p><p

3、>　　引言………………………………….1</p><p><b>　　1 材料與方法3</b></p><p>　　1.1 實(shí)驗(yàn)材料………………………………………………………………….….3</p><p>　　1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品3</p><p>　　1.1.2 主要生化試劑（盒）3</p>

4、<p>　　1.1.3 主要試劑及培養(yǎng)基配制3</p><p>　　1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器4</p><p>　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法……………………………………………………………………..5</p><p>　　1.2.1 樣品處理5</p><p>　　1.2.2 平板劃線分離和純化5</p><p&g

5、t;　　1.2.3 細(xì)菌DNA提取6</p><p>　　1.2.4 電泳檢測(cè)7</p><p>　　1.2.5 16SrDNA的擴(kuò)增7</p><p>　　1.2.6 PCR反應(yīng)條件8</p><p><b>　　2 結(jié)果與討論9</b></p><p>　　2.1 生物量統(tǒng)計(jì)…………

6、…………………………………….………………….9</p><p>　　2.2 形態(tài)學(xué)觀察…………………………………………………………………10</p><p>　　2.3 細(xì)菌16S rDNA多樣性分析……………………………….………..……..12</p><p>　　2.3.1 DNA的提取、純化和PCR擴(kuò)增12</p><p>　　2

7、.3.2 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析13</p><p>　　3 討論和小結(jié)18</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)19</b></p><p>　　致謝…………………………………………………………………………………..錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p>　　鮸魚腸道微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性 </p><

8、;p>　　[摘要]鮸魚（Miichthys miiuy）是廣泛分布我國(guó)東海、南海海域名貴的海水養(yǎng)殖品種，對(duì)鮸魚腸道微生物多樣性的研究有助于人們更深入了解鮸魚人工養(yǎng)殖技術(shù)。本文利用基于16SrDNA的分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)鮸魚腸道微生物可培養(yǎng)部分進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：此次試驗(yàn)檢測(cè)到的鮸魚消化道微生物主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)、漫游球菌屬(Vagococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus）、代爾夫特菌屬(Delft

9、ia)、 伯克氏菌屬(Burkholderia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、 不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter) 、泛菌屬(Pantoea) 、希萬(wàn)氏菌屬(Shewanella)。  初步結(jié)論是γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria）的菌株在鮸魚消化道微生物中是優(yōu)勢(shì)的類群，在所有可培養(yǎng)菌株中占優(yōu)勢(shì)地位。</p><p>　　[關(guān)鍵詞]消化道微生物；鮸魚；16SrDNA;；

10、群落多樣性</p><p>　　The diversity and microbial community structure of Miichthys miiuy</p><p>　　[Abstract]：Miichthys miiuy， a kind of valuable sea-water aquiculture species, which is widely distribut

11、ed in the East China Sea, South China Sea area. The study on Miichthys miiuy 's intestinal microbial diversity gives people a better understanding of its artificial breeding technology. Using the 16SrDNA-based molecu

12、lar biology techniques, this paper will study the intestinal microflora of Miichthys miiuy. The result:the intestinal microorganisms detected in croaker ish are mainly (Bacillus)、 (</p><p>　　[Key words]：gast

13、rointestinal microflora;Miichthys miiuy; 16SrDNA; community diversity</p><p><b>　　引言</b></p><p>　　魚類腸道菌群是腸道的正常組成部分，是腸道微生物與宿主以及所處的水生環(huán)境形成的相互依賴、相互制約的微生態(tài)系，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、免疫反應(yīng)以及器官的發(fā)育等方面具有其他因素

14、不可替代的作用，并且影響到魚類的生長(zhǎng)、發(fā)育、生理和病理。而且目前，國(guó)內(nèi)對(duì)腸道微生物的研究主要集中在人類及畜禽動(dòng)物[5]，對(duì)魚類腸道菌群組成的分析的研究卻較為為少見(jiàn)[6]。微生態(tài)學(xué)研究表明，環(huán)境條件的輕微改變可導(dǎo)致機(jī)體微生態(tài)系統(tǒng)的變化，造成菌群失調(diào)。腸道微生態(tài)系統(tǒng)的破壞還可引起內(nèi)外源性感染，干擾機(jī)體營(yíng)養(yǎng)代謝和免疫功能甚至嚴(yán)重影響機(jī)體健康狀態(tài)，導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生。因此對(duì)腸道菌群組成多樣性進(jìn)行研究具有至關(guān)重要的意義[1]。 </p

15、><p>　　國(guó)內(nèi)對(duì)魚類腸道菌群的研究起步相對(duì)較晚，主要集中在條件致病菌與腸道菌群關(guān)系的研究[2]、外界因素對(duì)腸道菌群影響的研究和腸道菌群對(duì)宿主的消化和生長(zhǎng)的影響研究[4]。而且，魚類養(yǎng)殖在我國(guó)具有悠久的歷史，當(dāng)今在我國(guó)沿海多種經(jīng)營(yíng)工程中占居越來(lái)越重要的地位。但在魚類流行病防治的方法和提高魚苗成活率方面仍然存在著不少問(wèn)題，比如說(shuō)在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展過(guò)程中，人們忽視了生態(tài)養(yǎng)殖，在動(dòng)物疾病發(fā)生時(shí)濫用藥物，致使其產(chǎn)品中的

16、藥物殘留對(duì)人體健康危害極大。如何進(jìn)行健康養(yǎng)殖也成為大家關(guān)心的問(wèn)題。魚類胃腸道正常微生物區(qū)系在魚類營(yíng)養(yǎng)、健康、防病、免疫等方面發(fā)揮著重要作用。從19世紀(jì)法國(guó)微生物學(xué)家巴斯德提出正常菌群對(duì)宿主是有益的學(xué)說(shuō)以來(lái)，人們對(duì)畜禽胃腸道正常微生物群的組成、定制規(guī)律及其與宿主關(guān)系有了越來(lái)越多的了解口。魚類胃腸道微生物在正常情況下，各種菌群處于穩(wěn)定的平衡狀態(tài)，保證其胃腸道正常的消化和吸收。同時(shí)，有益菌群定殖于胃腸道內(nèi)壁黏膜，形成的非特異性生物保護(hù)屏障，能

17、夠抑制病原菌在消化道壁的定殖，維持胃腸道正常的微生態(tài)平衡。當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生變化或飼料變更等應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，這種理想的微生物區(qū)系平衡會(huì)受到?jīng)_擊，消化道內(nèi)的有害菌群</p><p>　　在研究方法上，由于傳統(tǒng)的基于微生物純化、培養(yǎng)的微生物分類方法研究腸道微生物群落只能研究可培養(yǎng)微生物，不可避免地會(huì)遺漏腸道中不可培養(yǎng)的微生物，而且在菌體形態(tài)、菌落形態(tài)、顏色變化等方面的判斷帶有很強(qiáng)的主觀性，因而有著不可逾越的缺陷和不足。198

18、3年問(wèn)世的PCR技術(shù)是分子生物學(xué)的一個(gè)革命性突破，也是現(xiàn)代分子生物學(xué)的基本技術(shù)。1986年，Pace等將Woese研究系統(tǒng)發(fā)育的rRNA測(cè)序技術(shù)用于分析自然微生物群落生態(tài)，從此微生物生態(tài)學(xué)研究就進(jìn)入了一個(gè)新的階段[7]。雖然此次課題做的事可培養(yǎng)部分微生物的分離純化，但是主要還是運(yùn)動(dòng)了16SrDNA序列檢測(cè)的分子生物學(xué)技術(shù)?，F(xiàn)代分子生物學(xué)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)的不足，為現(xiàn)代微生物資源的研究與開(kāi)發(fā)開(kāi)辟了新天地。分子生物學(xué)技術(shù)已越來(lái)越廣泛

19、地用于微生物多樣性研究。經(jīng)過(guò)近二十年的研究，腸道微生物的分子生物學(xué)研究技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到了一個(gè)新的階段，涌現(xiàn)了許多有效的研究方法，為此次研究提供了了技術(shù)支持[8]。</p><p>　　此次研究主要運(yùn)用了16SrDNA序列檢測(cè)的分子生物學(xué)技術(shù)。對(duì)鮸魚幾個(gè)部位的消化道菌群進(jìn)行了分離鑒定，做了相關(guān)的形態(tài)特征，革蘭氏染色，電泳檢測(cè)，PCR擴(kuò)增等相關(guān)實(shí)驗(yàn)，建立了鮸魚消化道微生物系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，確定了這鮸魚腸道內(nèi)可培養(yǎng)部分細(xì)菌

20、的多樣性和分布以及建立了它們的16SrDNA指紋圖譜，并分析了它們之間的相似性，從而為本地區(qū)魚類疾病的防治、微生物類添加劑以及微生態(tài)育種提供理論依據(jù)</p><p><b>　　材料與方法</b></p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)樣品</b></p&

21、gt;<p>　　選擇體重7.5kg的無(wú)外傷健壯活潑鮸魚用于試驗(yàn)，所用試驗(yàn)用魚自浙江省溫州市外海水域深水養(yǎng)殖網(wǎng)箱。</p><p>　　1,1,2 主要生化試劑（盒）</p><p>　　TaKaRa Taq 寶生物工程（大連）有限公司</p><p>

22、;　　DL2000 DNA marker寶生物工程（大連）有限公司</p><p>　　引物(27f 1492r) 上海生工科技公司</p><p>　　細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒</p><p>　　1.1.3主要試劑及培養(yǎng)基配制</p><p&g

23、t;　　* 50×TAE的配制（1L）</p><p>　　Tris 242g</p><p>　　冰醋酸 57.1ml</p><p>　　EDTA（0.5mol/L,pH=

24、8.0） 100ml</p><p>　　使用前50倍稀釋為1×TAE，即可用于瓊脂糖凝膠的配制和電泳。</p><p>　　* 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制（1L）</p><p>　　牛肉膏 3g</p><p>　　蛋白胨 10g</p><p>

25、;　　Nacl 5g</p><p>　　瓊脂 15～20g</p><p>　　水 1000ml</p><p>　　使用前調(diào)至合適pH，即可倒平板。</p><p>　　* 6×甘油上樣緩沖液的配制（100ml）</p

26、><p>　　甘油 50ml</p><p>　　1%溴酚藍(lán) 5ml</p><p>　　EDTA 30mmol</p><p>　　使用前取1ml該溶液，按1:2000的比例加

27、入0.5μl SYBR Green I（invitrogen）核酸染料。</p><p>　　* LB培養(yǎng)基（1L，pH=7.5）</p><p>　　Trypetone 10g</p><p>　　Yeast Extract 5g</p><p>

28、　　NaCl 10g</p><p>　　向液體培養(yǎng)基中加入15g/L瓊脂粉即為固體培養(yǎng)基；向培養(yǎng)基中加入300μl 20%（200mg/ml）氨芐青霉素即為Amp抗性培養(yǎng)基。</p><p><b>　　* X-gal貯液</b></p><p>　　將X-gal粉末溶解于二甲

29、基亞砜（DMSO）中，配成20mg/mL的貯液，分裝后避光保存于-20℃以備使用，無(wú)須過(guò)濾或滅菌。</p><p><b>　　* IPTG溶液</b></p><p>　　將IPTG粉末溶于無(wú)菌水中，配成200mg/mL的溶液，分裝后保存于-20℃以備使用，無(wú)須過(guò)濾或滅菌。</p><p><b>　　1.1.4實(shí)驗(yàn)儀器</b

30、></p><p>　　表1實(shí)驗(yàn)所用儀器及生產(chǎn)廠家</p><p>　　Table 1 equipments and manufactures in the experiment</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p><b>　　樣品處理</b></p>

31、<p>　　將取到的鮸魚在保證其存活的條件下運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，然后在魚體表面用75酒精消毒，用在無(wú)菌條件下按照無(wú)菌操作程序剪肛、系線、掀腸壁，在每條魚腸道的不同位置取樣進(jìn)，取其前腸、中腸、后腸、幽門、前胃、后胃、口咽7個(gè)部位樣品。按順序?qū)⑷〉降臉悠窐?biāo)作M.for, M.mid,M.hin ,M.pyl, M.pro,M.hs，M.op、放到超低溫冰箱-70度保存。</p><p>　　1.2.2平板劃線分離和

32、純化</p><p>　　1）將取到的7個(gè)部位的樣品剪碎，放到滅菌鍋的EP管中，加入無(wú)菌水進(jìn)行搖勻。</p><p>　　2）取lmL混合液以10倍遞增稀釋方法（一份混合液，九份無(wú)菌水，再取一份第一只管中溶液，加九份無(wú)菌水，依次類推），將其稀釋至10-1，10-2，10-3倍。分別記為A，B，C。</p><p>　　3）右手持盛培養(yǎng)基的三角燒瓶置火焰旁邊，用左手瓶

33、塞輕輕地拔出，瓶口對(duì)著火焰；然后用右手手掌邊緣或小指與無(wú)名指夾住瓶塞（也可將瓶塞放在左手邊緣或小指與無(wú)名指之間夾住。如果三角燒瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基一次用完，瓶塞則不必夾在手中）左手持培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰旁打開(kāi)一縫，迅速導(dǎo)入培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置桌面上，待凝后即為平板。</p><p>　　4）將之前存放的樣品拿出，放到無(wú)菌操作間中，將左手斜持平板底，右手持接種環(huán)。接

34、種環(huán)在火焰上滅菌，冷卻后，沾取一接種環(huán)標(biāo)本，先在平板的一端涂開(kāi)，并從此處開(kāi)始向下劃密集的平行線，約占平板面積的一半。</p><p>　　5）將平板轉(zhuǎn)180°角，從平板另一端開(kāi)始也劃密集的平行線，直到劃滿平板的剩余部分。</p><p>　　將平板底放入蓋內(nèi)，接種環(huán)火焰滅菌后放下，將平板倒置，37℃培養(yǎng)。</p><p>　　6)從分離的平板上單個(gè)菌落挑取

35、少量菌苔，涂在載玻片上，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的個(gè)體形態(tài)，結(jié)合菌落形態(tài)特征，綜合分析。如不純，仍需平板分離法進(jìn)行純化，直至確認(rèn)為純培養(yǎng)為止。</p><p>　　7）記錄形態(tài)特征，進(jìn)行革蘭氏染色，記錄結(jié)果。</p><p>　　1.2.3細(xì)菌DNA提取</p><p>　　1ml、0.05g為例。采用TIANampBacteriaDNAkit來(lái)進(jìn)行細(xì)菌DNA提取，在使用

36、試劑來(lái)提取DNA之前，先要注意以下步驟：</p><p>　　1）第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說(shuō)明先在緩沖液GD和漂洗液PW中加入無(wú)水乙醇。</p><p>　　2）樣品應(yīng)該避免反復(fù)凍融，否者會(huì)導(dǎo)致提取的DNA片段較小、提取量下降。</p><p>　　3）若緩沖液GA或GB當(dāng)中有沉淀，可在56℃水浴中重新溶解，并搖勻后使用。</p><p&g

37、t;　　4）所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)，室溫下離心。</p><p><b>　　提取步驟：</b></p><p>　　1）取細(xì)菌培養(yǎng)液1ml，10000rpm（11500xg）離心一分鐘，盡量洗凈上清。</p><p>　　2）向菌體沉淀中加入200ul緩沖液GA，震蕩至菌體徹底懸浮。注意：對(duì)于較難破壁的革蘭氏陽(yáng)性菌，可略過(guò)第二步驟，加

38、入溶菌酶進(jìn)行破壁處理，具體方法為：加入180ul緩沖液20mM Tris，pH8.0；2 mM Na2-EDTA;1.2%Triton)終濃度為20mg/ml的溶菌酶（溶菌酶必須用溶菌酶干粉溶解在緩沖液中進(jìn)行配制，否則會(huì)導(dǎo)致溶菌酶無(wú)活性），37度處理30分鐘以上。如果需要去除RNA，可加入4 ul RNaseA（100mg/ml）溶液</p><p>　　3）向管中加入20ul蛋白酶K溶液，混勻。</p&

39、gt;<p>　　4）加入220ul緩沖液GB，震蕩15秒，70℃放置10分鐘，溶液變得清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管壁內(nèi)壁水珠。注意：加入緩沖液GB時(shí)可能產(chǎn)生白色沉淀。一般70℃放置時(shí)會(huì)消失，不會(huì)影響后續(xù)試驗(yàn)。如溶液未變的清亮，說(shuō)明細(xì)胞裂解的不徹底，可能導(dǎo)致提取DNA量少喝提取出的DNA不純。</p><p>　　5）加220ul無(wú)水乙醇，充分震蕩混勻15秒，此時(shí)可能出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管壁內(nèi)壁的

40、水珠。</p><p>　　6）將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm（13400xg）離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。</p><p>　　7）向吸附柱CB3中加入500ul緩沖液GD（檢查是否加入無(wú)水乙醇），12000rpm（13400xg）離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。</p>&

41、lt;p>　　8）向吸附柱CB3中加入600ul緩沖液PW（檢查是否加入無(wú)水乙醇），12000rpm（13400xg））離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。</p><p>　　9）重復(fù)操作步驟8。</p><p>　　10）將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm（13400xg）離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干媳婦材料中殘余的漂

42、洗液。注意：這一步目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切PCR等）實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　11）將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，將吸附膜的中間部位懸空滴加50-200ul洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12000rpm（13400xg）離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50ul，體積過(guò)小影響回收率。洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響

43、，若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)（可以用NaOH將水的pH調(diào)至此范圍，pH值低于7會(huì)降低洗脫效率；且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2分鐘，12000rpm（13400xg）離心2分鐘。</p><p><b>　　1.2.3電泳檢測(cè)</b></p><p>　　

44、將上一步中所提取的沉積物總DNA用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以DL2000DNA Marker作為標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA，在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照。DNA片段大小正確，條帶均一的直接用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。</p><p>　　1.2.416SrDNA的擴(kuò)增</p><p>　　使用細(xì)菌16S rDNA通用引物：27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-

45、TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′），使用實(shí)驗(yàn)方法2中提取得到的DNA作為模板。PCR反應(yīng)體系如下：</p><p>　　10x PCR緩沖液：2.5μL</p><p>　　25mM MgCl2:2.5μL</p><p>　?。?mM）dNTP：2.5μL</p><p>　　Taq酶：0.5uL（0.2μL，10u/μL

46、）</p><p>　　5μM的引物（27F）：1.0μL</p><p>　　5μM的引物（1492r）：1.0μL</p><p>　　模板DNA：1.0μL</p><p>　　加dd H2O補(bǔ)至25μL</p><p>　　1.2.5 PCR反應(yīng)條件</p><p>　　使用T-Grad

47、ient PCR儀，反應(yīng)條件如下：</p><p>　　95℃預(yù)變性5min，</p><p>　　94℃ 1min；</p><p>　　56.5℃ 30S； 循環(huán)35次</p><p>　　72℃ 2min；</p><p>　　72℃ 10min</p>

48、;<p>　　采用1.2%瓊脂糖膠，DL2000做為marker進(jìn)行電泳檢測(cè)16SrDNA擴(kuò)增情況，檢測(cè)結(jié)果較好的于4℃冰箱保存。16S rDNA擴(kuò)增片段在1500bp左右的克隆產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。</p><p><b>　　結(jié)果與討論</b></p><p><b>　　生物量統(tǒng)計(jì)</b></p&g

49、t;<p>　　從表2.1可以很明顯地看出鮸魚消化道細(xì)菌數(shù)量大部分分布在腸道，總體趨勢(shì)是前腸63%＞后腸11%＞中腸5%，周文豪，楊雨輝等發(fā)現(xiàn)鯉魚，草魚等淡水微生物腸道菌群的數(shù)量具有從前腸到后腸逐漸增多的現(xiàn)象，于是猜測(cè)可能是由于腸道內(nèi)容物由前向后推進(jìn)的緣故，也可能是腸道內(nèi)容物及其環(huán)境更有利于微生物生長(zhǎng)繁殖[12]。顯然和此次試驗(yàn)結(jié)果不同。而目前為止海水魚腸道菌群數(shù)量分布還有待驗(yàn)證，但從此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，海水魚腸道微生物分布

50、和淡水魚腸道菌群分布不一樣。具體原因還有待研究。</p><p>　　此次在前胃后胃并沒(méi)有找到多少菌群，可能跟分離時(shí)培養(yǎng)基pH和胃里pH不同，因此分離不到細(xì)菌，不過(guò)幽門處菌群含量18%遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于前胃1%和后胃1%。幽門是胃部和小腸的接口處，pH相對(duì)較高，因此分離到了細(xì)菌。馮曉燕等學(xué)者研究結(jié)果指出：海水魚主要消化工作集中在胃部。因此胃部分離到的菌落應(yīng)該遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止如此，因?yàn)轷|魚前胃后胃的pH在1.14左右，而幽門的pH在

51、6.40左右，因此猜測(cè)胃此次胃部分離到的菌株只是胃里面的部分菌群，大部分菌群由于培養(yǎng)基pH問(wèn)題無(wú)法培養(yǎng)。而口咽分離得到的細(xì)菌只占全部菌群的1%，證明口咽咽在鮸魚進(jìn)行消化活動(dòng)時(shí)起的作用微乎其微。</p><p>　　總而言之，此次分離得到的菌群大部分集中在腸道，占所有菌群的79%，其次是胃部占20%，口咽只占1%，由此可見(jiàn)鮸魚消化道可培養(yǎng)部分菌群的數(shù)量關(guān)系是腸道＞胃＞口咽。幾乎所有的研究都是以腸道菌群內(nèi)容物為研究對(duì)

52、象，對(duì)腸壁菌群的研究極少，而腸壁菌群才是真正意義上的定植菌株。因此，魚類腸壁菌群分布和作用尚須今后深入研究。</p><p>　　表1 各組織中細(xì)菌數(shù)量分布</p><p>　　Table 1 The number of bacteria distribution in Different organizations</p><p>　　注：“+++”表示數(shù)量太多，

53、無(wú)法統(tǒng)計(jì)?！?”表示平板中沒(méi)有長(zhǎng)出菌落,“/”代表不符合要求，無(wú)法計(jì)數(shù)</p><p><b>　　形態(tài)學(xué)觀察 </b></p><p>　　從表3經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)可以得到，純化后共135個(gè)菌株，形態(tài)特征幾乎全部呈桿狀或只有少量球狀或者弧狀，由于此次試驗(yàn)分離的是可培養(yǎng)部分菌株。因此，可得出結(jié)論鮸魚消化微生物可培養(yǎng)部分細(xì)菌形態(tài)主要以桿狀為主。共43個(gè)菌株在革蘭氏染色中呈陽(yáng)性，

54、占總菌落數(shù)的31.8%。其中前腸10個(gè)，中腸16個(gè)，后腸13個(gè)，幽門3個(gè)，口咽1個(gè)，前胃后胃均為0。剩余92個(gè)革蘭氏染色呈陰性，占總分離菌落數(shù)的68.2%。其中前腸24個(gè)，中腸21個(gè)，后腸18個(gè)，幽門18個(gè)，前胃后胃共8個(gè)，口咽3個(gè)。由此可以初步討論出，在鮸魚消化道中，革蘭氏陰性菌株是優(yōu)勢(shì)菌株，且大部分分布在腸道，占38.3%，在其他消化道所占比例很小，在胃中只占10.3%。進(jìn)一步驗(yàn)證了眾多學(xué)者研究的出來(lái)的結(jié)論：海水魚腸道菌群中的優(yōu)勢(shì)菌

55、為革蘭氏陰性菌，同時(shí)也存在革蘭氏陽(yáng)性菌。具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2。 </p><p>　　表2 細(xì)菌形態(tài)及革蘭氏染色觀察</p><p>　　Table 2 bacterial morphology and Gram staining results</p><p>　　圖1鮸魚消化道分離的各菌群革蘭氏染色結(jié)果</p><p>　　Fig1 The

56、 Bacterial and and the Gram staining results</p><p>　　細(xì)菌16S rDNA多樣性分析</p><p>　　2.3.1DNA的提取、純化和PCR擴(kuò)增</p><p>　　細(xì)菌總DNA提取之后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖：</p><p>　　圖2 PCR產(chǎn)物純化后電泳圖</p>

57、;<p>　　Fig2 the purification of PCR production in the agarose gel</p><p>　　使用細(xì)菌16S rDNA通用引物：27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′），使用純化后的細(xì)菌DNA作為模板。進(jìn)行PCR擴(kuò)增從純化，將純化后的DNA使用1.2

58、%瓊脂糖膠，DL2000做為marker進(jìn)行電泳檢測(cè)。從圖中可以發(fā)現(xiàn)pr.03、f.03等10個(gè)擴(kuò)增序列，條帶亮度高，證明DNA含量高，擴(kuò)增效果好。但是m.09、hs.05等16個(gè)PCR產(chǎn)物無(wú)明顯條帶，可能與溫度有關(guān)，采用53-60℃的溫度梯度PCR進(jìn)行擴(kuò)增，電泳檢測(cè)有明顯條帶出現(xiàn)，說(shuō)明擴(kuò)增效果較好，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。</p><p>　　2.3.2系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析</p>&l

59、t;p>　　2.3.2.1稀釋曲線</p><p>　　公司測(cè)回的序列通過(guò)Seqman軟件進(jìn)行序列拼接，一共得到有效序列26個(gè)，然后采用DOTUR軟件對(duì)有效序列進(jìn)行OUT分類，在進(jìn)化距離D為0.02時(shí)，共計(jì)得到24個(gè)OUT，同樣進(jìn)化距離D為0.02時(shí)繪制多樣性稀釋曲線如圖2.3.2.1，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，該曲線與45度角平分線接近，并且曲線上端上升變緩，說(shuō)明物種的多樣性水平較高。</p><

60、;p><b>　　圖3 稀釋曲線</b></p><p>　　Fig 3 Dilution curve</p><p>　　2.3.2.2生境分析</p><p>　　進(jìn)化樹中19個(gè)樣品序列在NCBI中找到的最相近克隆子及其生境如表4所示。</p><p>　　表3相近克隆子及其生境</p><

61、p>　　Table 3 Similar to the clones and their habitats</p><p>　　據(jù)表4所示，登錄號(hào)為NR_025689.1漫游球菌屬是從碎牛肉中分離得到的，部分漫游球菌屬的細(xì)菌能引起人類感染。國(guó)外已經(jīng)有許多報(bào)告。登錄號(hào)為JF784032.1的葡萄球菌屬是在印度東海岸中發(fā)現(xiàn)，多數(shù)為非致病菌，但少數(shù)也能治病。 登錄號(hào)為HQ236088.1的泛菌屬是在中國(guó)南京的龍山鉀

62、礦首次發(fā)現(xiàn)，是代謝和發(fā)酵類型的化能異養(yǎng)菌。不動(dòng)桿菌屬則是在飛機(jī)機(jī)艙空氣中發(fā)現(xiàn)。對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)討論，表中共10屬菌發(fā)現(xiàn)的生境各不相同。</p><p>　　2.3.2.2系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析</p><p>　　經(jīng)過(guò)OUT分類后的24個(gè)序列與genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性比較，然后將數(shù)據(jù)庫(kù)中相似性大于95%的序列導(dǎo)出，利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2.3.2.2。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，

63、實(shí)驗(yàn)得到的克隆序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列能夠較好的融合的在一起，并且彼此之間具有較近的親緣關(guān)系。</p><p>　　圖4鮸魚消化道微生物系統(tǒng)發(fā)育樹</p><p>　　Fig 4 The Microbial phylogenetic tree of Miichthys miiuy</p><p>　　從表4和圖4可以看到，有7株菌屬于厚壁菌門(Firmicutes)其中

64、一株屬于漫游球菌屬(Vagococcus)2株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)2株屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus）。除去O01相似度為72%外，其余相似度都為100%。通常菌株相似度達(dá)98%以上，則可認(rèn)為是同一個(gè)總?cè)?。另外兩株未知種屬，不過(guò)根據(jù)其相似度，估計(jì)其屬于厚壁菌門(Firmicutes)芽孢桿菌目(Bacillales)。剩下所有菌株均屬于變形菌門(Proteobacteria)。歸為β-變形菌綱(Betapro

65、teobacteria) 和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria）兩個(gè)大綱。其中2株屬于β-變形菌綱(Betaproteobacteria)，剩余10株屬于 γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria）具體種屬可見(jiàn)表2.3.2.2。屬于γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria）有10個(gè)樣品菌株，并且包括4個(gè)亞目(伯克氏菌目，假單胞菌目、腸桿菌目和交替單胞菌目)。很明顯γ-變形桿菌綱的菌株是鮸魚消化道

66、中是優(yōu)勢(shì)菌株，由于實(shí)驗(yàn)室最近幾年對(duì)東海大陸架沉積物</p><p>　　同時(shí)，在鮸魚消化道內(nèi)檢測(cè)出的不動(dòng)桿菌屬和假單胞菌，周宗澄、倪純治等在鯔魚(Mugil cephalus)、黃鰭綢魚(Sparus latus)等于上都檢測(cè)到了這兩個(gè)菌屬，進(jìn)一步驗(yàn)證了這兩種菌是海水魚消化道中最常見(jiàn)的細(xì)菌[14-15]。</p><p>　　綜上所述，鮸魚消化道微生物區(qū)系的形成和其生存環(huán)境、食性和總類都有

67、著聯(lián)系。</p><p><b>　　討論和小結(jié)</b></p><p>　　腸道微生物是一個(gè)復(fù)雜多樣的群體，同時(shí)也是動(dòng)物體的重要組成部分。魚類腸道中每克內(nèi)含物中大約存在108個(gè)異養(yǎng)性微生物和105個(gè)厭氧細(xì)菌，它們與宿主相互依存并相互影響。腸道菌群在魚類的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中擔(dān)當(dāng)非常重要的作用，它既要參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，同時(shí)也要擔(dān)當(dāng)機(jī)體的防御功能，維護(hù)機(jī)體健康[16-

68、17]。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析技術(shù)鮸魚消化道菌群的多樣性進(jìn)行分析，分析它的腸道菌群和其他同一食性魚類或者不同食性魚類在同一條件下的差異，得出結(jié)論食性差異大的魚類之間腸道菌群差異也更為明顯。本研究證明，16SrDNA技術(shù)是一種能夠快速有效地研究魚類腸道菌群的技術(shù)，是較其它方法更簡(jiǎn)單、靈敏度更高、可重復(fù)性和可靠性較好，且能較為全面反映菌群結(jié)構(gòu)多樣性的方法。</p><p>　　不

69、過(guò)本次研究依然存在不足之處，比如提取樣品過(guò)少，純化后的單菌落沒(méi)有進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)，對(duì)后來(lái)的結(jié)果分析造成很大不便。如果能結(jié)合不可培養(yǎng)部分對(duì)鮸魚消化道微生物進(jìn)行定量分析，那么此次研究的意義將遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止于此，但是總體上，此次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果還是比較令人滿意。雖然沒(méi)有確定了這鮸魚腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群的種類和數(shù)量，但是對(duì)菌群的的種屬和分布都有大體上的了解。從而為本地區(qū)魚類疾病的防治、微生物類添加劑以及生態(tài)育種提供理論依據(jù)。</p><p>

70、　　鮸魚作為我國(guó)東海著名的經(jīng)濟(jì)魚種，通過(guò)這次對(duì)鮸魚消化道微生物的研究，未來(lái)幾年可以在此研究基礎(chǔ)上研究鮸魚腸道菌群的功能及微生態(tài)制劑對(duì)鮸魚腸道菌群功能的影響。希望可以通過(guò)對(duì)鮸魚腸道菌群的研究，更好的了解消化道菌群在鮸魚生長(zhǎng)發(fā)育所發(fā)揮的作用，從而更好的通過(guò)鮸魚人工養(yǎng)殖項(xiàng)目為社會(huì)產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[

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