具有緩釋功能的魚膠原誘導(dǎo)再生膜的制備及表征

1、<p>　　單位代碼 10006 </p><p>　　學(xué) 號(hào) 10101015 </p><p>　　1分類號(hào) R318.08 </p><p><b>　　畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)</b></p><p>　　具有緩釋功能的魚膠原誘導(dǎo)

2、再生膜的制備及表征</p><p>　　2014 年 6月 </p><p>　學(xué)院名稱生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院</p><p>　專業(yè)名稱生物工程</p><p>　學(xué)生姓名吳哲</p><p>　指導(dǎo)教師周鋼</p><p><b>　　論文封面書脊</b></p>

3、;<p><b>　　北京航空航天大學(xué)</b></p><p>　　本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）任務(wù)書</p><p>　?、?、畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）題目：</p><p>　　具有緩釋功能的魚膠原誘導(dǎo)再生膜的制備及表征

4、 </p><p>　?、?、畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）使用的原始資料（數(shù)據(jù)）及設(shè)計(jì)技術(shù)要求：</p><p>　　確保原始數(shù)據(jù)的真實(shí)性,不違背學(xué)術(shù)要求及道德底線.在本實(shí)驗(yàn)中使用的大部分原始資料及數(shù)據(jù)為掃描電鏡下圖片分析、IR紅外光譜分析以及分光光度計(jì)對(duì)體外緩釋進(jìn)行檢測(cè)。 </p>

5、;<p>　　本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)有：具有緩釋功能的微球囊的制備，魚膠原誘導(dǎo)再生膜的冷凍干燥，紅外光譜檢測(cè)特征峰，掃描電鏡等。

6、 </p><p>　　Ⅲ、畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）工作內(nèi)容：</p><p>　　1月20日-3月2日 文獻(xiàn)調(diào)研 </p><p>　　3月2日-3月15日 魚膠原誘導(dǎo)再生膜制備的預(yù)實(shí)驗(yàn) </p><p>　　3月15日-3月2

7、0日 魚膠原誘導(dǎo)再生膜的制備和表征 </p><p>　　3月20日-4月1日 具有緩釋功能的微球囊制備的預(yù)實(shí)驗(yàn) </p><p>　　4月1日- 4月20日 具有緩釋功能的微球囊的制備和表征 </p><p>　　4月20日- 5月10日微球囊與膠原誘導(dǎo)再生膜的復(fù)合及表征 </p><p>　　5月10

8、日- 6月5日 數(shù)據(jù)分析處理，完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書寫，準(zhǔn)備答辯 </p><p><b>　?、?、主要參考資料：</b></p><p>　　E.H.Groeneveld, J.P.Van den Bergh, P. Holzmann, C.M. Bruggenkate, D.B. Tuinzing,E.H. Burger, Mineralization process

9、es in demineralized bone matrix grafts in human maxillary sinus floor elevations[J]. Biomed. Mater. Res. 1999: 393–402. </p><p>　　W. Suchanek, M. Yoshimura, Processing and properties of hydroxyapatite-based

10、biomaterials for use as hard tissue replacement[J]. Mater. Res.1998:94–117.</p><p>　　K.A. Hing, S.M. Best, K.E. Tanner, W. Bonfield, Quantification of bone in growth within bone-derived porous hydroxyapatite

11、 implants of varying density[J]. Mater.Sci. Mater. Med. 1999:663–670.</p><p>　　D.M. Liu, Fabrication and characterization of porous hydroxyapatite granules,Biomaterials 1996:1955–1957.</p><p>　　

12、S.H. Li, J.R. Wijn, P. Layrolle, K. de Groot, Synthesis of macroporous hydroxyapatite scaffolds for bone tissue engineering[J]. Biomed. Mater. Res. 2002:109–120.</p><p>　　l. Kong, Y. Gao,W. Gao, Y. Gong, N.

13、Zhao, X. Zhao, Preparation and characterization of nano-hydroxyapatite/chitosan composite scaffold[J]. Biomed. Mater. Res. 2005:275–282.</p><p>　　L. Wang, Y. Li, Y. Zuo, L. Zhang, Q. Zou, L. Cheng, H. Jiang,

14、 Porous bioactive scaffold of aliphatic polyurethane and hydroxyapatite for tissue regeneration, Biomed.Mater.2009: 1–7.</p><p>　　G. Wei, G.P. Ma,Structure and properties of nano-hydrocyapatite/polymer compo

15、site scaffolds for bone tissue engineering,Biomaterials 2004:4749–4757.</p><p>　　Y.C. Fu, H. Nie, M.L. Ho, C.K. Wang, C.H. Wang, Optimized bone regeneration basedon sustained release from three-dimensional f

16、ibrous PLGA/Hap composite scaffolds loaded with BMP-2, Biotechn. Bioeng. 2008: 996–1006. </p><p>　　生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 學(xué)院 生物工程 專業(yè)類 101011

17、班</p><p><b>　　學(xué)生 吳哲 </b></p><p>　　畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）時(shí)間： 2014 年 3 月 1 日至 2014 年 6 月 1 日</p><p>　　答辯時(shí)間： 年 月 日</p><p>　　成 績： </p>

18、;<p>　　指導(dǎo)教師： 周鋼 </p><p>　　兼職教師或答疑教師（并指出所負(fù)責(zé)部分）：</p><p>　　系（教研室） 主任（簽字）： </p><p>　　注：任務(wù)書應(yīng)該附在已完成的畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的首頁。</p><p><b>　　本人聲明&l

19、t;/b></p><p>　　我聲明，本論文及其研究工作是由本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨(dú)立完成的，在完成論文時(shí)所利用的一切資料均已在參考文獻(xiàn)中列出。</p><p><b>　　作者：吳哲</b></p><p><b>　　簽字：</b></p><p>　　時(shí)間：2014年6月</p>

20、;<p>　　具有緩釋功能的魚膠原誘導(dǎo)再生膜的制備及表征</p><p>　　學(xué) 生：吳哲 </p><p><b>　　指導(dǎo)教師：周鋼</b></p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　近年以來已經(jīng)有多種藥物實(shí)現(xiàn)了以殼聚糖微球作為緩釋載體，在生

21、物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景，成為緩控緩釋劑研究的熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)以殼聚糖微球作為藥物緩釋載體，并將其與魚膠原誘導(dǎo)再生膜復(fù)合，以達(dá)到提高誘導(dǎo)再生膜性能的目的。本實(shí)驗(yàn)以殼聚糖溶液為水相、液體石蠟為油相形成“油包水”型乳液，以香草醛為交聯(lián)劑， 采用乳化交聯(lián)法制得殼聚糖微球；本實(shí)驗(yàn)自行從廢棄的魚鱗中提取魚膠原，采用的辦法是閃式提取法和酸溶鹽析法。再通過冷凍真空干燥的辦法將殼聚糖微球與魚膠原誘導(dǎo)再生膜結(jié)合起來。通過紅外光譜檢測(cè)和掃描式電子顯微

22、鏡來對(duì)二者的結(jié)合情況進(jìn)行分析。紅外光譜檢測(cè)顯示出與殼聚糖微球復(fù)合之后的誘導(dǎo)再生膜顯示出了兩者的特征峰，掃描式電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示, 載藥微球表面致密且球形度好, 微球粒徑在5~20μm之間，并觀察到殼聚糖微球和膠原誘導(dǎo)再生膜之間很好的結(jié)合。此外，采用分光光度計(jì)對(duì)載有巴薩藥物的復(fù)合誘導(dǎo)再生膜進(jìn)行體外緩釋檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明復(fù)合誘導(dǎo)再生膜緩釋效果明顯。</p><p>　　關(guān)鍵詞：殼聚糖，魚膠原，藥物緩釋，誘導(dǎo)再生膜

23、Preparation and characterization of fish collagen regeneration membrane with slow-release function</p><p>　　Author : WU Zhe</p><p>　　Tutor : ZHOU Gang</p><p><b>　　Abstract<

24、/b></p><p>　　In recent years there have been a variety of drugs that achieve a sustained release with chitosan microspheres as carriers which show a good prospect to become one of the hot slow controlled

25、release formulation studies in the biomedical field. In this study, chitosan microspheres as drug delivery works with fish collagen regeneration membrane in order to improve the ability of membrane. In this experiment, t

26、he chitosan solution as the aqueous phase , liquid paraffin oil phase to form a " water i</p><p>　　Key words：chitosan, collagen, slow-release effect, regeneration membrane</p><p><b>　

27、　目 錄</b></p><p><b>　　1緒論1</b></p><p>　　1.1研究意義1</p><p>　　1.2研究現(xiàn)狀分析1</p><p><b>　　2研究方案7</b></p><p>　　2.1研究目標(biāo)7<

28、;/p><p>　　2.2研究內(nèi)容7</p><p>　　2.3基本原理8</p><p>　　2.4研究方案10</p><p><b>　　3實(shí)驗(yàn)步驟12</b></p><p>　　3.1從魚鱗中提取魚膠原作為制備骨誘導(dǎo)再生膜的原材料12</p><p&g

29、t;　　3.2殼聚糖載藥微球的制備12</p><p>　　3.3FTIR-650傅里葉紅外光譜分析儀操作步驟13</p><p>　　3.4掃描式電子顯微鏡操作步驟13</p><p>　　3.5Unico7200紫外可見分光光度計(jì)使用步驟14</p><p>　　3.6JY-82C視頻接觸角測(cè)量儀操作步驟14</

30、p><p>　　4實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析15</p><p>　　4.1紅外光譜分析15</p><p>　　4.2掃描式電子顯微鏡觀察22</p><p>　　4.3接觸角測(cè)量29</p><p>　　4.4復(fù)合微球囊后誘導(dǎo)再生膜的緩釋功能的體外檢測(cè)30</p><p><b&g

31、t;　　結(jié)論33</b></p><p><b>　　致謝34</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)35</b></p><p><b>　　緒論</b></p><p><b>　　研究意義</b></p><

32、;p>　　人體的頜骨尤其是牙槽骨是人體的骨骼中最活躍的部分，當(dāng)一個(gè)正畸力傳遞至牙槽骨時(shí)，受壓側(cè)牙槽骨吸收，張力側(cè)牙槽骨增生，不斷的進(jìn)行著更新和改建，從而產(chǎn)生所需的牙齒移動(dòng)，并且在新的位置上建立新的平衡[1]。外傷、腫瘤、囊腫、正畸等多種因素常會(huì)導(dǎo)致牙槽骨缺損，牙種植手術(shù)中經(jīng)常會(huì)遇到牙槽骨骨量不足的問題，這會(huì)使牙種植手術(shù)的效果受到限制,目前解決的方法不多，主要有兩種：一種是將填充材料充填到牙槽受損處，從而誘導(dǎo)骨再生，但修復(fù)后的牙槽骨

33、是否影響牙齒的移動(dòng)以及可能影響的程度，現(xiàn)在報(bào)道的研究甚少，而這對(duì)缺損牙槽骨修復(fù)后的錯(cuò)位和畸形矯正是很重要的；另一種是運(yùn)用生物醫(yī)學(xué)中組織工程原理誘導(dǎo)組織再生，誘導(dǎo)牙周組織中的成骨細(xì)胞增殖與分化參與再生過程，該過程叫做骨誘導(dǎo)再生過程，應(yīng)用技術(shù)為骨誘導(dǎo)再生技術(shù)（GBR）[1-2]。GBR技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵是手術(shù)中使用的骨誘導(dǎo)再生膜材料的選擇。目前得到廣泛應(yīng)用的誘導(dǎo)再生膜材料主要有金屬鈦膜和膠原膜：鈦膜降解性差，膠原大多源于哺乳動(dòng)物，應(yīng)用范圍受限，

34、且鈦膜和常用膠原膜成本昂貴，給病患造成了很高的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，能夠制備一種成本低廉，治療效果優(yōu)異的骨誘導(dǎo)再生膜材料是具有重要意義的科研課</p><p>　　另外,諸如增長因子、酶以及諸如細(xì)胞因子等許多蛋白質(zhì)類藥物對(duì)于組織再生都是必需的，并且這些細(xì)胞因子和蛋白質(zhì)都具有強(qiáng)效針對(duì)性且具體的治療或修復(fù)效果；然而，蛋白質(zhì)類藥物對(duì)于組織破壞或修復(fù)是非常脆弱的，導(dǎo)致經(jīng)常出現(xiàn)失去了生物活性的情況出現(xiàn)；這就需要具有更好的蛋白質(zhì)兼

35、容性的藥物輸送裝置[3]。因此,研制出一種既具有緩釋藥物功能又具有良好的生物相容性和誘導(dǎo)組織再生能力的藥物傳輸系統(tǒng)具有廣闊的發(fā)展前景[4]。</p><p><b>　　研究現(xiàn)狀分析</b></p><p>　　1.2.1關(guān)于誘導(dǎo)再生膜的材料選擇</p><p>　　目前，越來越多的學(xué)者致力于將骨誘導(dǎo)再生技術(shù)原理應(yīng)用于臨床實(shí)踐,但是由于所應(yīng)用的

36、屏障膜的性能的不同，往往各研究報(bào)道創(chuàng)口愈合，組織再生程度存在一定的差異[5]。</p><p>　　通過研究總結(jié)包括651例垂直型骨缺損的17項(xiàng)骨誘導(dǎo)再生技術(shù)臨床研究報(bào)道指出：在651例垂直型骨缺損的病例中，骨誘導(dǎo)再生手術(shù)術(shù)后一年發(fā)生附著喪失的病例約占2.7%，臨床附著獲得量少于2mm者為11%，附著獲得在2—3mm之間的為24.8%，附著獲得超過6mm者為21.2%；一些報(bào)道顯示根分歧病變?cè)诠钦T導(dǎo)再生手術(shù)術(shù)后一

37、年的組織再生程度也存在同樣的差異,故為了進(jìn)一步提高引導(dǎo)牙周組織再生術(shù)的臨床療效，辨明并控制影響其臨床效果的各方面因素，具有一定的臨床指導(dǎo)意義,在骨誘導(dǎo)再生技術(shù)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的其影響因素主要包括適應(yīng)癥的選擇，手術(shù)方法的確定，膜的選擇與使用等幾個(gè)方面，其中，膜的選擇是最為關(guān)鍵的[5]。</p><p>　　近年來，國內(nèi)科研人員經(jīng)過探討和實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用進(jìn)口的Bio-gide生物膜通過骨誘導(dǎo)再生技術(shù)來增加牙槽骨量，取得了較好的

38、效果（圖1.1）,但是進(jìn)口生物膜的成本很高，在膜形狀為25mm*25mm時(shí)售價(jià)為1400元人民幣，給患者增加了非常重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[6]。瑞士Geistlich公司生產(chǎn)的Bio-gide可以說是牙槽骨再生膜材料的生產(chǎn)的壟斷公司，如果這種情況得不到改善，對(duì)于需要骨再生膜材料治療的患者來說，在經(jīng)濟(jì)上無疑是非常被動(dòng)的,因此，我國急需國產(chǎn)生物膜引導(dǎo)骨再生技術(shù)增加牙種植床的骨量[7]。</p><p>　　圖1. 1 瑞士Ge

39、istlich公司生產(chǎn)的Bio-gide膜</p><p>　　牙槽骨誘導(dǎo)再生膜的必須具有優(yōu)秀的屏障功能，并且能夠?yàn)榧?xì)胞提供粘附位點(diǎn)，進(jìn)而增殖和分化,研究表明，“致密層-多孔層”的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)是最為科學(xué)合理的[9]。膜的致密層可以阻擋細(xì)胞并防止細(xì)胞長入，一方面，阻擋非成骨細(xì)胞向植骨區(qū)域生長，另一方面，允許成纖維細(xì)胞沿著膠原纖維附著;而膜的另外一層，多孔的網(wǎng)狀排列的膠原纖維利于成骨細(xì)胞融合入三維的框架結(jié)構(gòu)，從而支持骨的

40、再生.同時(shí),框架結(jié)構(gòu)中可以負(fù)載上具有緩釋功能的微球囊從而可以達(dá)到藥物的運(yùn)輸和緩釋的目的,對(duì)于雙層結(jié)構(gòu)的膜材料來說，不同的層被不同的細(xì)胞所占據(jù);在多孔層一側(cè)，細(xì)胞可以輕易地穿入膠原框架并在那里沿著光滑面生長[10]。</p><p>　　較高的親水性是牙槽骨誘導(dǎo)再生膜的另一個(gè)重要特性?，F(xiàn)有研究指出，材料的親水性可以對(duì)成骨細(xì)胞的粘附、鋪展行為和黏著斑激酶（FAK）表達(dá)造成影響。通過一系列的科學(xué)研究已經(jīng)證明，親水性高的

41、材料表面可以明顯增強(qiáng)成骨細(xì)胞在材料表面的粘附，能夠促進(jìn)細(xì)胞骨架沿一定方向伸展，促進(jìn)FAK的表達(dá)，從而綜合提高成骨細(xì)胞的生長和分化能力[4-5]。</p><p>　　牙周結(jié)締組織中I型膠原最多，因此引導(dǎo)組織再生膠原膜應(yīng)該以I型膠原作為其主要成分,I型膠原材料具有無抗原性、生物相容性好、能促進(jìn)細(xì)胞增殖、加快傷口愈合、降解產(chǎn)物無毒副作用等優(yōu)點(diǎn),隨著生物醫(yī)學(xué)材料產(chǎn)業(yè)和組織工程學(xué)的興起，它作為牙周組織工程的支架材料而倍受

42、關(guān)注,在骨誘導(dǎo)再生膜制備材料的選擇上，與金屬材料（鈦膜）相比，膠原也有非常突出的優(yōu)勢(shì)：首先，鈦膜是不可吸收膜，質(zhì)硬，有一定的抗力強(qiáng)度，有利于空間維持，但是光滑的表面也不利軟組織的附著，易傷口裂開暴露。而膠原膜是可吸收膜，由纖維狀的膠原構(gòu)成，具有良好的組織相容性，其抗張強(qiáng)度和彈性較高，免疫原性較低，在提供細(xì)胞屏蔽作用的同時(shí)，可完全降解，逐漸與周圍組織融為一體并在新骨形成后逐漸吸收，勿需二次手術(shù)取出；其次，鈦膜的結(jié)構(gòu)上無任何孔隙，限制了血液

43、血漿進(jìn)入植骨區(qū)，膠原膜通透性好，可允許血漿滲入膜下，保證膜下植入物的營養(yǎng)。最后，鈦膜的手術(shù)處理非常繁瑣，鈦膜暴露時(shí)，要盡量保持局部清潔，于組織瓣下注入派力奧，全身抗炎治療，防止繼發(fā)感染 如果保持2個(gè)月以上未發(fā)生感染，可以拆除鈦膜，這時(shí)對(duì)骨再生效果不會(huì)造成嚴(yán)重影響[11-12]。如果發(fā)生感染，則應(yīng)及時(shí)拆除鈦膜。</p><p>　　目前，膠原在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用的主要來源是陸地動(dòng)物源性膠原蛋白，如來自人的尸體和胎盤等。目前

44、常用的膠原材料存在以下幾方面的問題：①易造成動(dòng)物源疾病，由于人和哺乳動(dòng)物同源性很高，故易造成人畜共患病，如瘋牛病、口蹄疫和禽流感等；或者造成人體傳染病的傳染風(fēng)險(xiǎn)，如病毒性肝炎和艾滋病等； ②源自哺乳動(dòng)物的膠原蛋白，如豬膠原、牛膠原，由于宗教和文化問題，引起了一些宗教組織對(duì)其醫(yī)學(xué)應(yīng)用的反對(duì)；③陸地來源有限，為避免感染要通過復(fù)雜的過程提取，故已經(jīng)投入市場(chǎng)的膠原蛋白材料成本很高，同時(shí)售價(jià)高昂[14]。</p><p>

45、　　水生生物醫(yī)用材料是生物醫(yī)用材料和生物技術(shù)的重要組成部分，魚類中提取膠原蛋白相對(duì)從陸地動(dòng)物中提取膠原蛋白具有以下優(yōu)勢(shì)：①具有較高的生物安全性，對(duì)比陸地哺乳動(dòng)物，從水生生物中提取的生物大分子有效避免了陸地動(dòng)物疾病病毒傳播的風(fēng)險(xiǎn)； ②不存在文化宗教問題，可以在醫(yī)學(xué)材料方面廣泛應(yīng)用；③成本低廉：原料多為水產(chǎn)品加工行業(yè)的下腳料，生產(chǎn)加工成本相對(duì)低廉，產(chǎn)品附加值高，為低碳、綠色經(jīng)營模式提供了一條時(shí)間途徑，我們注意到，生活生產(chǎn)中產(chǎn)生大量廢棄的魚鱗

46、嚴(yán)重污染了環(huán)境，而魚鱗中膠原蛋白含量可高達(dá)55%，因此利用廢棄?mèng)~鱗提取大量的魚膠原蛋白，有效解決魚鱗環(huán)境污染并進(jìn)行了廢物利用[15]。</p><p>　　魚膠原蛋白是一種具有三螺旋結(jié)構(gòu)的天然高分子化合物，在醫(yī)藥、食品、日用化工、生物醫(yī)用材料存在巨大應(yīng)用潛力；魚膠原蛋白可以作為人工皮膚、人工食道以及氣管、燒傷保護(hù)膜、可降解手術(shù)縫線、止血海綿、緩釋藥物載體、優(yōu)良的止血材料等生物醫(yī)用材料，但是魚膠原的使用并不如陸地生

47、動(dòng)物的膠原蛋白的使用常見[11-12]。</p><p>　　對(duì)魚膠原進(jìn)行初步的結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)魚膠原蛋白主要含有I型膠原蛋白，分布在魚類的皮、骨、鱗等處，是有3條肽鏈擰成的螺旋形纖維狀蛋白質(zhì)；由于水生生態(tài)環(huán)境的特殊性（如高壓、低溫等），使得魚膠原蛋白在氨基酸的序列上與陸生動(dòng)物膠原蛋白有較為獨(dú)特的物化特性；魚膠原蛋白易溶于中性鹽溶液或稀酸，較易調(diào)制成可溶性膠原溶液，由于其魚膠原蛋白低抗原性的特點(diǎn)，使其在醫(yī)療和食品領(lǐng)

48、域中更是受到人們歡迎[13]。</p><p>　　用魚膠原作為骨誘導(dǎo)再生膜的制備材料，一方面能夠克服已應(yīng)用的材料的不足，另一方面具有極強(qiáng)的可塑性，能夠塑造成如圖1.2所示的“致密層-多孔層”雙層結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)再生膜結(jié)構(gòu)，同時(shí)具有良好的生物相容性與較高的親水性；從魚鱗中提取的魚膠原是一種天然的，未經(jīng)化學(xué)交聯(lián)處理的膠原膜，它同時(shí)具備操作簡便以及治療安全的特性，因此，使用魚膠原作為原材料制備骨誘導(dǎo)再生膜具有可實(shí)現(xiàn)性，本研

49、究選取的提取方式是從廢棄的魚鱗中提取魚膠原，變廢為寶復(fù)合綠色實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)要求，再加上可忽略不計(jì)的成本和廣闊的來源，這種綠色環(huán)保的試驗(yàn)方法有著更深層次的潛力和發(fā)展空間[3-4]。</p><p>　　圖 1.2 誘導(dǎo)再生膜的雙層結(jié)構(gòu)示意圖</p><p>　　1.2.2關(guān)于緩釋藥物的研究進(jìn)展</p><p>　　目前，膠原、明膠、白蛋白、透明質(zhì)酸等自然生物原料都廣泛地應(yīng)

50、用于緩釋類型的藥物輸送，應(yīng)用自然生物原料制造可控藥物輸送系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)就是它們比合成聚合物更具有極好的誘導(dǎo)骨再生的能力，在多種自然聚合物中，膠原作為一種主要的結(jié)締組織蛋白，展現(xiàn)出了它極高的生物兼容性，I型膠原是一種三重螺旋肽分子，它可以聚集成纖維，并且它在膠原酶的作用下具有生物可降解性，但是，由于膠原的低機(jī)械穩(wěn)定性和形狀穩(wěn)定性，現(xiàn)在的研究中并沒有可以將膠原直接作為藥物輸送載體的制備材料，另外，用膠原來進(jìn)行蛋白質(zhì)類藥物輸送系統(tǒng)的制備所面臨

51、的最主要挑戰(zhàn)就是，過于開放的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使得在基體中保留封裝蛋白質(zhì)不易進(jìn)行，因此必須找出固定封裝藥物的辦法[13]。</p><p>　　為了控制蛋白質(zhì)類藥物的輸送，許多方法被應(yīng)用過，最常用的方法就是化學(xué)交聯(lián)，比如使用戊二醛，然而，戊二醛的使用破壞了化學(xué)交聯(lián)結(jié)構(gòu)的生物兼容性，因?yàn)橛卸練埩粑锖头纸猱a(chǎn)物會(huì)在相當(dāng)程度上加劇細(xì)胞毒性和鈣化[12-13]。</p><p>　　因?yàn)榛瘜W(xué)交聯(lián)的弊端日益趨于

52、明顯，其他的封裝交聯(lián)方法的需求在日益提升，近年來，微球類藥物輸送系統(tǒng)得到了越來越多的關(guān)注，因?yàn)樗鼈兛勺⑸洌⑶夷軌蜉斔投喾N藥物，基于微球類藥物輸送系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)明顯，許多生物分解合成高分子聚合物都被用來制備可控制藥物輸送系統(tǒng)，為了適應(yīng)特殊需要，這些材料是可以進(jìn)行靶點(diǎn)和針對(duì)性的調(diào)整的，然而，這些原料都有其固有的缺點(diǎn)，除了在制備過程中因?qū)⒎庋b藥物暴露在有機(jī)溶劑和不適宜條件下而產(chǎn)生的破壞藥物生物活性的缺點(diǎn)之外，還有與其疏水性和酸性分解產(chǎn)物有關(guān)的蛋

53、白質(zhì)兼容性和穩(wěn)定性問題[15]。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)擬采用殼聚糖作為緩釋藥物的微球類基礎(chǔ)材料,殼聚糖(Chitosan)是一種天然的帶正電荷多糖，甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物, 無毒、無刺激性、無致敏性、無致突變作用、無溶血效應(yīng)，具有良好的生物降解性、生物相容性、生物粘附性和促進(jìn)藥物吸收的作用, 可作為化學(xué)藥物、多肽、蛋白質(zhì)藥物以及基因藥物的載體[15] ,殼聚糖載藥微球因具有藥物控釋、組織靶向、提高藥物穩(wěn)定性等

54、多方面優(yōu)勢(shì), 因而已成為近年來新型給藥系統(tǒng)研究的熱點(diǎn)[2-4]。目前殼聚糖微球的常用制備方法是乳化交聯(lián)法，可以制備包埋多種藥物的載藥微球, 微球粒徑較小且球形度好, 制備工藝簡單易行, 尤其是可望通過調(diào)控交聯(lián)程度來控制藥物釋放速率[6]。將殼聚糖制成載藥微球, 能夠控制藥物釋放速度, 降低藥物的毒副作用, 提高疏水性藥物對(duì)細(xì)胞膜的通透性, 改善藥物的穩(wěn)定性和改變給藥途徑, 延長藥物療效, 以及靶向給藥等,近年來已有多種藥物, 如吲哚美辛

55、、阿司匹林、塞來昔布、鹽酸小檗堿、5-氟尿嘧啶、順鉑、維生素E、胰島素等均實(shí)現(xiàn)了以殼聚糖微球作為緩釋控釋載體, 并實(shí)現(xiàn)了在胃、結(jié)腸、肝、腎、肺等部位給藥, 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[3]。</p><p><b>　　研究方案</b></p><p><b>　　研究目標(biāo)</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)的研究

56、目標(biāo)是尋找到一種可以封裝傳輸藥物并且對(duì)牙槽骨或者其他骨組織具有誘導(dǎo)再生能力的運(yùn)輸系統(tǒng)結(jié)構(gòu)。并且利用紅外光譜檢測(cè)分析和掃描式電子顯微鏡以及視頻接觸角測(cè)量儀對(duì)其進(jìn)行觀察檢測(cè)，并在體外對(duì)這種運(yùn)輸系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的緩釋功能做一個(gè)大致的描述和評(píng)價(jià)。</p><p><b>　　研究內(nèi)容</b></p><p>　　本課題研究內(nèi)容主要包括：</p><p>　　魚

57、膠原誘導(dǎo)再生膜的制備和表征</p><p>　　包括通過重力加載的辦法進(jìn)行“致密層”膠原誘導(dǎo)再生膜的制備以及作為微球囊載體的“多孔層”膠原誘導(dǎo)再生膜的制備。通過FTIR-650傅里葉紅外光譜分析儀來對(duì)膠原誘導(dǎo)再生膜進(jìn)行紅外光譜分析，分析結(jié)果通過與魚膠原特征吸收峰和吸收譜帶進(jìn)行比較來進(jìn)行官能團(tuán)的表征；通過掃描式電子顯微鏡觀察誘導(dǎo)再生膜的微觀結(jié)構(gòu)。</p><p>　　具有緩釋功能的微球囊的制

58、備和表征</p><p>　　以殼聚糖溶液為水相、液體石蠟為油相形成“油包水”型乳液, 以香草醛為交聯(lián)劑, 采用乳化交聯(lián)法制得殼聚糖微球囊。通過掃描式電子顯微鏡對(duì)制備得到的微球囊進(jìn)行微形貌的觀察以及微球囊直徑的測(cè)量。</p><p>　　微球囊與膠原誘導(dǎo)再生膜的復(fù)合</p><p>　　將制備好的殼聚糖微球囊加入到即將降到冰點(diǎn)的魚膠原水溶液中稍加攪拌后迅速冷凍，之后

59、在真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行冷凍干燥，即可得到復(fù)合了殼聚糖微球囊的魚膠原誘導(dǎo)再生膜。為了證明殼聚糖微球囊在魚膠原誘導(dǎo)再生膜中分布的均一性，實(shí)驗(yàn)在制備得到的負(fù)載了殼聚糖微球囊的魚膠原誘導(dǎo)再生膜上隨機(jī)選取五個(gè)點(diǎn)取少量樣品分別在FTIR-650傅里葉紅外光譜分析儀上進(jìn)行紅外光譜分析，觀察這五個(gè)點(diǎn)的紅外光譜圖中是否存在殼聚糖的特征吸收峰。此外，對(duì)復(fù)合了殼聚糖微球囊的魚膠原誘導(dǎo)再生膜，本實(shí)驗(yàn)有一個(gè)接觸角測(cè)量的部分簡單的說明誘導(dǎo)再生膜的親水性。</

60、p><p>　　復(fù)合微球囊后誘導(dǎo)再生膜的緩釋功能的體外檢測(cè)</p><p>　　選用巴薩藥物作為待測(cè)定緩釋功能的標(biāo)準(zhǔn)藥物。根據(jù)不同濃度的巴薩藥物溶液在590nm處的吸光度繪制巴薩藥物的吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。將復(fù)合裝載了巴薩藥物的殼聚糖微球囊的魚膠原誘導(dǎo)再生膜加入到50ml的磷酸鹽緩沖溶液中并密封入離心管。之后放置于三十七攝氏度的溫度條件下的PH240A恒溫箱中保存，每天取出約2.5ml的上清液加入到

61、比色皿中放入分光光度計(jì)，以磷酸鹽緩沖溶液作為標(biāo)準(zhǔn)液在590nm處進(jìn)行溶液吸光度的測(cè)定，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)定量測(cè)定溶液中巴薩藥物的濃度。取出的上清液部分用等體積的磷酸鹽緩沖鹽水替換掉，持續(xù)此操作直到溶液內(nèi)巴薩藥物的濃度趨于穩(wěn)定。記錄并繪制巴薩藥物濃度--時(shí)間圖表示出復(fù)合了殼聚糖微球囊之后魚膠原誘導(dǎo)再生膜的緩釋功能情況。</p><p><b>　　基本原理</b></p>&

62、lt;p><b>　　乳化交聯(lián)法</b></p><p>　　以聚合物和藥物為材料制備載藥微球最常用的方法是先制備成油/水、水/油、水/油/水、油/水/油型乳液后，再根據(jù)具體的用途選擇適當(dāng)方法使乳液固化成微球。乳化交聯(lián)法就是根據(jù)藥物與天然或人工高分子材料的性質(zhì)制成油/水、水/油、水/油/水、油/水/油型單乳化與復(fù)乳化的乳液體系，在形成穩(wěn)定的乳液后，采用連續(xù)攪拌等方法加入交聯(lián)劑，由于交聯(lián)

63、劑中的活性基團(tuán)（醛基）可以和高分子材料的氨基或醇基發(fā)生縮合反應(yīng)，交聯(lián)制得微球，同時(shí)使微球逐漸固化，經(jīng)過過濾、洗滌和干燥等操作得到最終的載藥微球，其粒徑通常在1~100μm范圍內(nèi)。可以參加胺醛縮合反應(yīng)的高分子材料有淀粉、蛋白類等，而參加醇醛縮合反應(yīng)的水溶性高分子材料有聚乙烯醇、殼聚糖等。乳化交聯(lián)法主要包括四個(gè)步驟：藥物的加入、乳液的形成、溶劑的除去、微球的干燥及回收。而乳化交聯(lián)法制備微球的關(guān)鍵因素是乳液體系的形成，因?yàn)槿橐后w系形成步驟決定

64、著微球的粒徑和粒徑分布，而乳滴的外形、穩(wěn)定性和固化時(shí)發(fā)生的變化則影響微球的形態(tài)。</p><p><b>　　分光光度法</b></p><p>　　分光光度法（Spectrophotometry）是一門對(duì)光譜進(jìn)行量化研究的分析方法。主要涉及的電磁波譜范圍是可見光、近紫外線與近紅外線。這種方法不同于電磁波譜與時(shí)間分辨光譜。將含有各種波長的混合光分散為各種單色光，使每種

65、單色光依次通過某一濃度溶液，測(cè)定溶液對(duì)每種光波的吸光度，繪出吸收光譜。由于物質(zhì)的吸收光區(qū)域和強(qiáng)度與結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，根據(jù)特有的吸收光譜可作分子結(jié)構(gòu)分析。此外，利用特定波長的單色光分別透過標(biāo)準(zhǔn)溶液與待測(cè)溶液，比較其吸光度，可作定量分析（朗博--比爾定律）。</p><p><b>　　朗博--比爾定律</b></p><p>　　又稱比爾定律、比耳定律、朗伯-比爾定律、布格

66、-朗伯-比爾定律（Bouguer–Lambert–Beer law），是光吸收的基本定律，適用于所有的電磁輻射和所有的吸光物質(zhì)，包括氣體、固體、液體、分子、原子和離子。比爾-朗伯定律是吸光光度法、比色分析法和光電比色法的定量基礎(chǔ)。光被吸收的量正比于光程中產(chǎn)生光吸收的分子數(shù)目。公式：</p><p>　　A = kcd （2.1）</p><p><b>　　式中：</

67、b></p><p>　　A——吸光度(absorbance)舊稱光密度(optical density)；</p><p><b>　　C——樣品濃度；</b></p><p>　　d——光程，即盛放溶液的液槽的透光厚度；</p><p>　　k——光被吸收的比例系數(shù)；</p><p>　

68、　當(dāng)濃度采用摩爾濃度時(shí)，k為摩爾吸收系數(shù)。它與吸收物質(zhì)的性質(zhì)及入射光的波長λ有關(guān)。</p><p><b>　　酸溶鹽析法</b></p><p>　　酸溶鹽析法是提取純化某些具有特定屬性的蛋白質(zhì)的方法。包括“酸溶”和“鹽析”。蛋白質(zhì)某些蛋白質(zhì)（如魚膠原）大分子難溶于水，為了提取純化蛋白質(zhì)，有時(shí)需要用適當(dāng)濃度的酸或堿來促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解，此為“酸溶”。蛋白質(zhì)在水溶液中的

69、溶解度取決于蛋白質(zhì)分子表面離子周圍的水分子數(shù)目，亦即主要是由蛋白質(zhì)分子外周親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽后，由于中性鹽與水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，致使蛋白質(zhì)分子周圍的水化層減弱乃至消失。同時(shí)，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，之蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。由于各種蛋白質(zhì)在不同鹽濃度中的溶解度不同，不同飽和度的鹽溶液沉淀的

70、蛋白質(zhì)不同，從而使之從其他蛋白中分離出來。簡單的說就是將硫酸銨、硫化鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定性因素去除而沉淀，即“鹽析”。</p><p><b>　　研究方案</b></p><p><b>　　儀器設(shè)備、材料</b></p><p>　　其他儀器設(shè)備

71、：燒杯（100ml，250ml，500ml，1000ml，2000ml，5000ml）、藍(lán)色試劑瓶、離心管、磁力轉(zhuǎn)子、溫度計(jì)、超純水凈化設(shè)備、搖床、12孔板、注射器針筒、剪刀、水盆、鐵架臺(tái)等。</p><p><b>　　藥品</b></p><p>　　其他材料與試劑藥品：魚鱗，自配磷酸鹽緩沖液（PBS溶液）等。</p><p>　　主要藥品

72、試劑的配制與貯存</p><p>　　磷酸鹽緩沖溶液（PBS溶液）：1000ml蒸餾水中溶解0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀、2.9g磷酸氫二鈉以及8.0g氯化鈉藥品，充分混勻后分裝，高壓下蒸汽滅菌二十分鐘，4°C環(huán)境溫度下保存。</p><p>　　低濃度醋酸溶液：用于處理閃式提取機(jī)處理之后的魚膠原粗提液，溶解其中的魚膠原。取用高濃度醋酸溶液稀釋得到，保存在4°C環(huán)

73、境溫度下。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)步驟</b></p><p>　　從魚鱗中提取魚膠原作為制備骨誘導(dǎo)再生膜的原材料</p><p>　　魚鱗預(yù)處理：除去魚鱗粘連的魚皮，將魚鱗洗凈,曬干。用粉碎機(jī)切碎待處理魚鱗；</p><p>　　加入適量蒸餾水，閃式提取2次，每次2min，目測(cè)魚鱗已初步打碎即可；</p

74、><p>　　膠原蛋白提?。阂匀苊洷?:15-30加入低濃度醋酸溶液，混合均勻，放置4h，之后以3500-5500r/min轉(zhuǎn)速離心5-30 min，除去雜質(zhì)，取上清液，備用；</p><p>　　除去雜蛋白：將粗提液和 NaCl溶液按重量配比混合，以3500-5500r/min轉(zhuǎn)速離心5-30 min，棄去上清液，沉淀用10倍體積的0.5mol/L的乙酸溶解，以3500-5500r/min轉(zhuǎn)

75、速離心5-30 min。重復(fù)此步3次左右；</p><p>　　除酸以及除鹽：將幾次鹽析過后得到的上清液透析三天，每半天換一次蒸餾水。透析袋孔徑為3500；</p><p>　　干燥樣品：將透析過后的膠原溶液用真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥，即可得膠原蛋白制品；</p><p>　　制備出具有“致密層-多孔層”雙層結(jié)構(gòu)的魚膠原骨誘導(dǎo)再生膜材料；</p><

76、;p>　　通過重力加載的方式將冷凍干燥的魚膠原材料壓制成型為骨誘導(dǎo)再生膜的“致密層”；</p><p>　　在“致密層”的基礎(chǔ)上覆蓋未定型的魚膠原凝膠物質(zhì)，再次進(jìn)行統(tǒng)一的冷凍干燥處理；</p><p>　　殼聚糖載藥微球的制備</p><p>　　稱取50ml液體石蠟、1.5g Span、0.8g Tween 80以及1.5g硬脂酸鎂配成溶液作為油相；<

77、/p><p>　　在40°C水浴條件下恒溫?cái)嚢?0min，攪拌速度為800r/min；</p><p>　　配出15g質(zhì)量濃度為2.5%的殼聚糖乙酸溶液作為水相；</p><p>　　將水相加入已經(jīng)在攪拌中的油相，保持原轉(zhuǎn)速攪拌0.5h；</p><p>　　加入已配好的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的香草醛的乙醇溶液，攪拌3h-4h；</p

78、><p>　　加入30g石油醚，攪拌10min；</p><p>　　3500r/min的轉(zhuǎn)速離心分離固體產(chǎn)物；</p><p>　　用異丙醇溶液洗滌3-5次；</p><p>　　真空冷凍干燥12h；</p><p>　　將得到的殼聚糖微球均勻混合在未定型的魚膠原凝膠物質(zhì)中冷凍干燥。</p><p&g

79、t;　　FTIR-650傅里葉紅外光譜分析儀操作步驟</p><p>　　連接FTIR-650傅里葉紅外光譜分析儀和相對(duì)應(yīng)計(jì)算機(jī)的電源，打開位于FTIR-650傅里葉紅外光譜分析儀背部的開關(guān)和開啟計(jì)算機(jī)；</p><p>　　點(diǎn)擊電腦屏幕打開紅外光譜工作站軟件；</p><p>　　取適量待測(cè)樣品置于研缽中，研磨成細(xì)粉末狀； </p><p>

80、;　　加入適量溴化鉀，研磨成細(xì)粉末狀；</p><p>　　將粉末狀樣品轉(zhuǎn)移至壓片模具中并在DF-4壓片機(jī)上進(jìn)行壓片，10-20MPa壓制一分鐘即可；</p><p>　　點(diǎn)擊采樣品按鈕，按軟件提示進(jìn)行背景采集；</p><p>　　將壓制好的樣品片置于樣品倉內(nèi)的樣品架上，點(diǎn)擊確定進(jìn)行樣品數(shù)據(jù)采集；</p><p>　　保留采集得到的***.

81、csv數(shù)據(jù)文件，用自己攜帶的移動(dòng)存儲(chǔ)設(shè)備將數(shù)據(jù)拷貝出；</p><p>　　退出系統(tǒng)，關(guān)閉計(jì)算機(jī)電源和FTIR-650傅里葉紅外光譜分析儀；</p><p>　　可自行選取采用的數(shù)據(jù)分析處理軟件或是畫圖軟件，本實(shí)驗(yàn)采用的是origin8.5軟件。</p><p>　　掃描式電子顯微鏡操作步驟</p><p>　　用剪刀或者刀片剪取適當(dāng)大小的導(dǎo)

82、電膠粘在樣品座上，將待觀測(cè)的樣品放置于導(dǎo)電膠上粘牢固（對(duì)于導(dǎo)電性能不好且樣品塊較大的樣品應(yīng)提前予以噴金操作）；</p><p>　　點(diǎn)擊電腦屏幕上的“Vent”鍵放氣進(jìn)入樣品交換室內(nèi)部直至燈亮；</p><p>　　松開樣品交換室鎖扣，打開樣品交換室，取下原有的樣品臺(tái)，將已固定好樣品的樣品臺(tái)，放到送樣桿末端的卡抓內(nèi)（注意：樣品高度不能超過樣品臺(tái)高度，并且樣品臺(tái)下面的螺絲不能超過樣品臺(tái)下部凹

83、槽的平面）；</p><p>　　關(guān)閉樣品交換室門，扣好鎖扣；</p><p>　　按“pump”按鈕，開始抽真空，待真空達(dá)到一定程度，圖標(biāo)點(diǎn)亮；</p><p>　　按住鼠標(biāo)中部的滾輪上下拉動(dòng)樣品臺(tái)至一個(gè)便于觀察的位置；</p><p>　　觀察樣品室的真空“PVG”值，當(dāng)真空達(dá)到9.0×10-5Pa時(shí)，按下屏幕上的“beam o

84、n”鍵開始發(fā)射電子束，同時(shí)可以打開四個(gè)觀察窗口中便于觀察的那個(gè)，調(diào)節(jié)電壓數(shù)值使界面變得清晰；</p><p>　　操作鍵盤上按鍵調(diào)節(jié)黑白平衡“Quick View”，將放大倍率調(diào)至最低，點(diǎn)擊“Stage Map”，對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記，按順序?qū)悠愤M(jìn)行觀察；</p><p>　　操作鍵盤上按鍵“+”放大觀察倍數(shù)，操作鍵盤上按鍵“F7”進(jìn)入調(diào)節(jié)焦距界面；按住鼠標(biāo)中鍵左右滑動(dòng)調(diào)節(jié)焦距，如果過程中覺得

85、視野中光線進(jìn)量不足，可重新調(diào)節(jié)一次電子顯微鏡的黑白平衡即可獲得較為良好的視野亮度；</p><p>　　操作鍵盤上按鍵“F4”即可進(jìn)行視野范圍內(nèi)的拍照，拍照后可以選取屏幕上的直徑量取工具進(jìn)行標(biāo)注；</p><p>　　將拍得的照片保存在特定的文件夾中，用未曾使用過的光盤拷貝數(shù)據(jù)文件；</p><p>　　點(diǎn)擊屏幕上的“beam on”按鈕使其變色，取消電子注入；&l

86、t;/p><p>　　按下vent鍵放氣進(jìn)入樣品交換臺(tái)直至指示燈亮起；</p><p>　　拉開樣品交換室的門，取出樣品臺(tái)。</p><p>　　Unico7200紫外可見分光光度計(jì)使用步驟</p><p>　　連接電源，打開位于Unico7200紫外可見分光光度計(jì)背部的儀器開關(guān)；</p><p>　　將將要測(cè)量的待測(cè)溶液

87、和對(duì)比的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入不同的比色皿，并且插入樣品倉內(nèi)部的槽內(nèi)；</p><p>　　將旋鈕旋至需要測(cè)量的波長處，將樣品操控桿拉至標(biāo)準(zhǔn)樣溶液比色皿處，按下分光光度計(jì)上的調(diào)零鍵調(diào)零；</p><p>　　將樣品操縱桿拉至待測(cè)溶液比色皿處，從分光光度計(jì)的屏幕上讀出吸光度數(shù)據(jù)；</p><p>　　將讀出的吸光度數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時(shí)的回歸得到的線性方程中，根據(jù)朗博比爾定

88、律，可以得到溶液中此種物質(zhì)的濃度；</p><p>　　取出樣品倉中的裝樣比色皿，清洗留待下次使用；</p><p>　　關(guān)閉分光光度計(jì)的電源開關(guān)。</p><p>　　JY-82C視頻接觸角測(cè)量儀操作步驟</p><p>　　連接電源。打開JY-82C視頻接觸角測(cè)量儀開關(guān)和對(duì)應(yīng)的計(jì)算機(jī)的電源開關(guān)；</p><p>　

89、　在計(jì)算機(jī)的桌面上找到JY-82C軟件，打開；</p><p>　　取少量蒸餾水置于任意容器中，用視頻接觸角測(cè)量儀上的注射器吸取少量進(jìn)入注射器內(nèi)；</p><p>　　將待測(cè)樣品放在視頻接觸角測(cè)量儀測(cè)量臺(tái)上適當(dāng)?shù)奈恢茫?lt;/p><p>　　點(diǎn)擊JY-82C軟件內(nèi)的“活動(dòng)圖像”，即可即時(shí)觀察到待測(cè)樣品表面的情況，調(diào)節(jié)攝像頭和樣品臺(tái)的位置和角度使視野達(dá)到最佳；</

90、p><p>　　控制視頻接觸角測(cè)量儀上的注射器降低高度，在接近待測(cè)樣品的高度值時(shí)控制注射器滴下一滴蒸餾水（也可以根據(jù)需要是其他溶液）；</p><p>　　在計(jì)算機(jī)的軟件上觀察到較為適宜的視野，拍取圖像并保存；</p><p>　　選用“量角法”或是“量高法”取點(diǎn)測(cè)量蒸餾水和待測(cè)樣品的接觸角并保存，自行取用移動(dòng)存儲(chǔ)設(shè)備拷貝，留待以判斷待測(cè)樣品的親水性；</p>

91、;<p>　　關(guān)閉視頻接觸角測(cè)量儀和計(jì)算機(jī)，拔下電源。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析</b></p><p><b>　　紅外光譜分析</b></p><p>　　膠原誘導(dǎo)再生膜的紅外光譜表征</p><p>　　圖4.1為魚膠原制備得到的誘導(dǎo)再生膜實(shí)物圖，圖4.2為傅里

92、葉變換紅外光譜儀（FTIR-650）測(cè)試得到的紅外光譜檢測(cè)結(jié)果在origin8.5軟件上繪制圖像所得。表格4.1上列出了魚膠原的特征吸收峰和特征吸收譜帶，從紅外光譜圖中可以看到，位于3340cm-1處的魚膠原特征峰為N-H伸縮振動(dòng)峰，它的存在說明了肽鍵間氫鍵的存在，而氫鍵的存在是I型膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的必須化學(xué)鍵，所以這個(gè)氮?dú)渖炜s振動(dòng)特征峰的存在一定程度上說明了魚膠原誘導(dǎo)再生膜中膠原成分的三螺旋結(jié)構(gòu)在提取工藝中沒有受到破壞，依然具備了完整性

93、；位于1660cm-1處的魚膠原特征吸收峰是由于魚膠原的酰胺I帶中存在碳氧雙鍵結(jié)構(gòu)，這個(gè)碳氧雙鍵結(jié)構(gòu)的伸縮振動(dòng)會(huì)引起紅外光譜上這個(gè)位置的特征吸收峰的出現(xiàn)，位于1550cm-1處的魚膠原特征吸收峰是由于膠原的酰胺II帶中中存在氨基結(jié)構(gòu)，這個(gè)氨基結(jié)構(gòu)的彎曲振動(dòng)會(huì)引起紅外光譜上這個(gè)位置的特征吸收峰的出現(xiàn)，位于1230-1450cm-1處的魚膠原特征吸收譜帶則是由于I型膠原中獨(dú)特的三螺旋空間結(jié)構(gòu)的存在，三螺旋空間結(jié)構(gòu)的不同方向不同自由度的伸縮振

94、動(dòng)和彎曲振動(dòng)共同引起了這個(gè)位置上出現(xiàn)了這個(gè)I型膠原獨(dú)有的特征吸</p><p>　　圖 4. 2 魚膠原誘導(dǎo)再生膜的紅外光譜圖</p><p>　　表 4. 1 魚膠原的特征吸收峰和特征吸收譜帶 cm-1</p><p>　　殼聚糖微球囊的紅外光譜表征</p><p>　　圖4.3為傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR-

95、650）測(cè)試殼聚糖微球囊得到的紅外光譜檢測(cè)結(jié)果在origin8.5軟件上繪制圖像所得。表格4.2上列出了殼聚糖的特征吸收峰和特征吸收譜帶，從紅外光譜圖中可以看到，位于3435cm-1處的寬峰是由于特征峰的重疊而產(chǎn)生的，兩個(gè)重疊的特征峰分別是由于羥基的伸縮振動(dòng)和氮?dú)滏I的伸縮振動(dòng)引起的，羥基的伸縮振動(dòng)峰和氮?dú)滏I的伸縮振動(dòng)峰相互重疊所以在這個(gè)位置產(chǎn)生了這個(gè)多重吸收寬峰；位于2923cm-1和2849cm-1處的兩個(gè)殼聚糖特征吸收峰則都是由于殼

96、聚糖中含有不同空間結(jié)構(gòu)的碳?xì)滏I，這兩個(gè)碳?xì)滏I的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生了這兩個(gè)位置的特征吸收峰；位于1627cm-1處的殼聚糖特征吸收峰是由于伯胺結(jié)構(gòu)中含有對(duì)稱的氮?dú)滏I，對(duì)稱的氮?dú)滏I的彎曲振動(dòng)則會(huì)引起這個(gè)位置的特征吸收峰，從殼聚糖微球囊的紅外圖譜中可以較為明顯的觀察到這個(gè)伯胺結(jié)構(gòu)中氮?dú)滏I的對(duì)稱彎曲振動(dòng)峰有了一個(gè)輕微的藍(lán)移，這是由于實(shí)驗(yàn)方案的微球囊制備方法所導(dǎo)致的。實(shí)驗(yàn)選用的微球囊制備方法是乳化交聯(lián)法，選用的交聯(lián)劑是香草醛，而香草醛中的醛基在制備過程

97、中與殼聚糖的氨基反應(yīng)結(jié)合生成一個(gè)希夫堿結(jié)構(gòu)，這個(gè)副反應(yīng)導(dǎo)致了伯胺結(jié)構(gòu)中氮?dú)滏I的</p><p>　　一個(gè)輕微的藍(lán)移，同時(shí)，香草醛中苯環(huán)的振動(dòng)吸收峰（1594cm-1、819cm-1處）在紅外圖譜中都可以看到；位于1383cm-1處的殼聚糖特征吸收峰的出現(xiàn)是由于殼聚糖中存在碳氮鍵，這個(gè)碳氮鍵的伸縮振動(dòng)導(dǎo)致了這個(gè)位置上的特征吸收峰的出現(xiàn)；位于1154cm-1處的殼聚糖特征峰的出現(xiàn)是由于殼聚糖中存在環(huán)結(jié)構(gòu)，環(huán)結(jié)構(gòu)中存在

98、著的碳氧鍵導(dǎo)致了這個(gè)位置上的特征吸收峰的出現(xiàn)；位于1080cm-1處的殼聚糖特征峰的出現(xiàn)是因?yàn)闅ぞ厶侵写嬖谔佳蹑I結(jié)構(gòu)，碳氧鍵結(jié)構(gòu)的伸縮振動(dòng)導(dǎo)致了這個(gè)位置上出現(xiàn)了殼聚糖的特征吸收峰，從制備得到的殼聚糖微球囊的紅外檢測(cè)圖譜中可以觀察到原位于1080cm-1處的碳氧鍵的伸縮振動(dòng)峰有了一個(gè)輕微的藍(lán)移，在1118cm-1處可以觀察到這個(gè)特征吸收峰，這個(gè)藍(lán)移是由于碳氧鍵結(jié)構(gòu)變化形成了一個(gè)新的碳--氧--碳結(jié)構(gòu)，這個(gè)新的碳--氧--碳結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)導(dǎo)致了

99、原碳氧鍵的特征吸收峰的藍(lán)移出現(xiàn)。通過對(duì)制備得到的殼聚糖微球囊進(jìn)行紅外圖譜檢測(cè)結(jié)果分析，研究方案中選取的制備殼聚糖微球囊的方法是乳化交聯(lián)法，選用的交聯(lián)劑—香草醛一定程度上影響了殼聚糖原本的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了原伯胺鍵中的氮?dú)滏I結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成了一個(gè)希夫堿結(jié)構(gòu)，</p><p>　　圖 4. 3 殼聚糖微球囊的紅外光譜圖</p><p>　　表 4. 2 殼聚糖的特征吸收峰

100、 cm-1</p><p>　　復(fù)合了殼聚糖微球囊的魚膠原誘導(dǎo)再生膜的紅外光譜表征</p><p>　　圖4.4為在傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR-650）上測(cè)試復(fù)合了殼聚糖微球囊的魚膠原誘導(dǎo)再生膜得到的紅外光譜檢測(cè)結(jié)果在origin8.5軟件上繪制圖像所得。另外也將殼聚糖與魚膠原的純凈物同樣放到一起對(duì)比分析。表格4.3上列出了全部屬于殼聚糖和魚膠原的特征吸收峰，從圖中可以

101、看出，位于1118cm-1處的殼聚糖特征吸收峰發(fā)生了一個(gè)輕微的紅移，推測(cè)是由于與魚膠原之間形成了一個(gè)分子間作用力，影響了原本的碳-氧-碳鍵結(jié)構(gòu)的伸縮振動(dòng)，從而導(dǎo)致了這個(gè)位置上的伸縮振動(dòng)峰產(chǎn)生了這個(gè)輕微的紅移。由于殼聚糖微球囊和魚膠原誘導(dǎo)再生膜之間屬于一個(gè)物理形態(tài)上的結(jié)合，所以在紅外光譜上，可以很明顯的觀察到復(fù)合了殼聚糖微球囊的魚膠原誘導(dǎo)再生膜上存在著原本屬于殼聚糖微球囊和魚膠原誘導(dǎo)再生膜的特征吸收峰，并且基本未發(fā)生變化或紅、藍(lán)移。<

102、;/p><p>　　圖 4. 4 復(fù)合了殼聚糖微球囊的誘導(dǎo)再生膜的紅外光譜圖</p><p>　　表 4. 3 魚膠原和殼聚糖的特征吸收峰 cm-1</p><p>　　復(fù)合了殼聚糖微球囊的魚膠原誘導(dǎo)再生膜的均一性紅外表征</p><p>　　為了證明殼聚糖微球囊在魚膠原誘導(dǎo)再生膜中分布均勻，我們?cè)趶?fù)合了殼聚糖微球囊的魚膠原誘導(dǎo)再生膜上隨機(jī)選

103、取了五個(gè)點(diǎn)，取出適量樣品在傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR-650）上進(jìn)行了紅外圖譜分析表征，圖4.5為復(fù)合了殼聚糖微球囊的魚膠原誘導(dǎo)再生膜上隨機(jī)選取的五個(gè)點(diǎn)的紅外圖譜，表格4.3上列出了全部屬于殼聚糖和魚膠原的特征吸收峰，從圖中可以很明顯的觀察到，復(fù)合了殼聚糖微球囊的魚膠原誘導(dǎo)再生膜上隨機(jī)選取的五個(gè)點(diǎn)均具有殼聚糖和魚膠原的所有特征吸收峰，這表示了殼聚糖微球囊在魚膠原誘導(dǎo)再生膜中分布的均勻性良好。 </p><p>

104、;　　圖 4. 5 在誘導(dǎo)再生膜上隨機(jī)選取的五個(gè)點(diǎn)的紅外光譜圖</p><p>　　掃描式電子顯微鏡觀察</p><p>　　殼聚糖微球囊的掃描式電子顯微鏡下觀察</p><p>　　圖為殼聚糖微球囊在掃描式電子顯微鏡下的觀察結(jié)果，圖4.6和圖4.7是低放大倍數(shù)下觀察拍攝的實(shí)驗(yàn)圖片，從這兩張放大倍數(shù)分別為400*和800*的掃描式電子顯微鏡下拍得的照片可以較為清晰的

105、在宏觀上觀察制備得到的殼聚糖微球囊，從這兩張低放大倍率的圖片中觀察，我們通過乳化交聯(lián)法制備得到的殼聚糖微球囊成球型普遍較為良好，成型率高說明了乳化交聯(lián)法是一個(gè)可以推廣應(yīng)用的制備微球囊的方法之一。另外，圖4.8和圖4.9是相比較而言在較高的放大倍數(shù)下觀察拍攝的殼聚糖微球囊的實(shí)驗(yàn)圖片，從這兩張放大倍數(shù)分別為8000*和16000*的掃描式電子顯微鏡下拍得的照片可以較為清晰的在微觀結(jié)構(gòu)上觀察制備得到的殼聚糖微球囊，并且可以在掃描式電子顯微鏡得

106、到的照片中進(jìn)行微球囊直徑的評(píng)價(jià)。從圖4.8和圖4.9中可以很清晰的觀察到實(shí)驗(yàn)制備得到的殼聚糖微球囊具有很好的微形貌，即使在提高放大倍數(shù)的情況下也能保持觀察到良好的微球形態(tài)；從這兩張高倍率的掃描式電子顯微鏡圖像中可以粗略的觀察到，制備得到的殼聚糖微球囊的直徑大約在5微米到20微米之間。</p><p>　　圖 4. 6 殼聚糖微球囊的掃描電鏡圖片（400*）</p><p>　　圖 4. 7

107、殼聚糖微球囊的掃描電鏡圖片（800*）</p><p>　　圖 4. 8殼聚糖微球囊的掃描電鏡圖片（8000*）</p><p>　　圖 4. 9 殼聚糖微球囊的掃描電鏡圖片（12000*）</p><p>　　魚膠原誘導(dǎo)再生膜的掃描式電子顯微鏡下觀察</p><p>　　圖4.10、圖4.11、圖4.12為制備得到的魚膠原誘導(dǎo)再生膜在掃描式

108、電子顯微鏡下的觀察結(jié)果，圖4.10是較低放大倍數(shù)下觀察拍攝的實(shí)驗(yàn)圖片，從這張放大倍數(shù)2500*的掃描式電子顯微鏡下拍得的照片可以較為清晰的觀察制備得到的魚膠原誘導(dǎo)再生膜，從這張低放大倍率的圖片中觀察，我們通過酸溶鹽析法制備得到的魚膠原誘導(dǎo)再生膜的膜結(jié)構(gòu)均勻有規(guī)律。另外，圖4.11和圖4.12是同一位置在較高的放大倍數(shù)下觀察拍攝的魚膠原誘導(dǎo)再生膜的電鏡圖片，從這兩張放大倍數(shù)分別為5000*和10000*的掃描式電子顯微鏡下拍得的照片可以較