納米tio2對斑馬魚肝損傷基因表達的影響【開題報告+文獻綜述+畢業(yè)設計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報告</b></p><p><b>　　生物技術</b></p><p>　　納米TiO2對斑馬魚肝損傷基因表達的影響</p><p>　　一、選題的背景與意義</p>&l

2、t;p>　　納米技術是當今高科技發(fā)展中最快的領域之一，大約超過200種的納米材料被用于個人、商業(yè)、醫(yī)藥和軍事等領域。隨著納米材料所帶來的利益的同時，對納米材料釋放到環(huán)境中并對環(huán)境及生物所造成的潛在毒性也受到越來越多學者的關注。有研究表明，當宏觀物質被粉碎成納米級超微顆粒后，其諸多方面的性質均發(fā)生了根本性改變，納米顆粒特殊的理化性質（如小尺寸效應、表面效應、量子尺寸效應和宏觀量子隧道效應等） 使其與宏觀材料在生物活性和生物動力學過程

3、等方面產(chǎn)生了明顯差異，因此對機體產(chǎn)生的生物效應和作用強度也發(fā)生了本質上的改變，一些原本無毒或微毒的顆粒粒徑達到納米級時毒性明顯增強，一些原本無害的材料在達到納米級時可能會對人體產(chǎn)生各種潛在危害（汪冰等，2005；朱融融等，2007）. 常規(guī)二氧化鈦（TiO2） 是一種低毒粉塵，在許多粉塵的毒理學研究中往往被用作無毒的對照粉塵，然而當其達到納米級時（納米TiO2）其毒性明顯增強. 研究表明，納米TiO2 染毒后可在肝大量富集，肝是納米Ti

4、O2 在生物體內的主要靶器官（王江雪等，2008）</p><p>　　目前研究納米TiO2顆粒對生物的影響及生物效應的受試生物主要為小鼠和細胞,對水生生物的效應研究較少,更未見有研究納米TiO2對魚肝損傷及相關基因表達的報道.然而, 使用納米材料可能導致排放到水環(huán)境 ，并危及水生物與水生生態(tài)系統(tǒng).斑馬魚除了具有經(jīng)濟、觀賞價值外，還被廣泛應用于發(fā)育生物學、毒理學、分子生物學等研究，被喻為理想的分子生物學的脊椎動物

5、模型，具有很高的科研價值, 是外界環(huán)境變化，如重金屬鹽類、農藥、工業(yè)污水、放射性物質等對人類影響的良好研究材料。本項目希望通過納米TiO2對斑馬魚肝損傷及其相關基因表達的研究,為該領域的研究提供參考,積累數(shù)據(jù),更為深入了解納米TiO2 的毒性及其機制提供基礎依據(jù).</p><p>　　二、研究的基本內容與擬解決的主要問題：</p><p><b>　　研究的基本內容：</b

6、></p><p>　　從轉錄水平研究TiO2對魚的生物需效應，包括RNA含量的測定；</p><p>　　從分子水平研究TiO2對魚的生物學效應，如測定相關基因的表達。</p><p><b>　　擬解決的主要問題：</b></p><p>　　如何提取出比較純的斑馬魚肝，并將其在液氮中完善的保存一段時間。<

7、;/p><p>　　用液氮研磨法提取出比較純凈的RNA。</p><p>　　以Actin作內參配制等濃度的RNA量</p><p><b>　　引物的設計。</b></p><p>　　熟練運用RT-PCR技術及瓊脂糖凝膠電泳技術檢測待測基因的表達情況。</p><p>　　三、研究的方法與技術路線

8、：</p><p>　　研究的方法：對斑馬魚進行納米材料TiO2的染毒培養(yǎng)，提取出斑馬魚肝中的RNA，以Actin作內參配制等濃度的RNA量，RT-PCR技術及瓊脂糖凝膠電泳技術檢測待測基因的表達情況。</p><p><b>　　技術路線：</b></p><p>　　四、研究的總體安排與進度：</p><p>　　2

9、010年11月到2010年12月：查閱相關文獻，了解實驗原理與實驗過程。</p><p>　　2011年2月到2011年3月，RNA的提取，跑RT-PCR。</p><p>　　2011年3月到2011年4月，后期數(shù)據(jù)的處理。</p><p><b>　　五、主要參考文獻：</b></p><p>　　[1] 朱融融,

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19、料在羅非魚飼料中應用試驗[J]. 中國水產(chǎn), 2007, 3: 78-79 .</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻綜述</b></p><p><b>　　生物技術</b></p><p>　　熱激蛋白基因hsp70的研究進展</p><p>　　摘要：熱激蛋白HSP70是一類高度保守的蛋白

20、質，普遍的存在于原核和真核生物中。hsp70在細胞不同功能中發(fā)揮著作用。它可以作為分子伴侶參與細胞的發(fā)育、生長和分化。近年來hsp70與疾病的關系成為了研究的熱點。本文從hsp70結構，功能以及在疾病領域最新研究進展展開介紹。最后總結了hsp70的研究進展，并展望了未來hsp的研究方向。</p><p>　　關鍵詞：熱激蛋白； hsp70； 研究進展</p><p><b>　　

21、1熱激蛋白HSP</b></p><p>　　1.1熱激蛋白的發(fā)現(xiàn)及研究歷史</p><p>　　生物細胞在受熱或者其它理化因素(如乙醇、病毒感染 氨基酸類似物、DNA 損傷、缺氧、重金屬離子等) 應激后發(fā)生熱休克反應，可以抑制一些正常蛋白質的合成，同時啟動一類新的蛋白質合成基因(熱休克蛋白基因)產(chǎn)生熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)[1]。</p

22、><p>　　在1962年，Ritossa觀察到在果蠅幼蟲的飼養(yǎng)溫度從25cc提高到30cc后，發(fā)現(xiàn)在其唾液腺多絲染色體的某一區(qū)域出現(xiàn)了膨突，這表明了該區(qū)域的基因轉錄增強，為熱激反應。1974年Tissieres等利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離技術得到熱休克反應所產(chǎn)生的一組新蛋白質(分子量為70kDa和26kDa)，為熱激蛋白。Nover(1984年)與Soger(1987年)先后闡明了編碼HSP的序列，基因結構和位點，

23、并確定其機理是由于高熱影響到該基因中的上游調節(jié)序列，熱激元件(Heat Shock Element，HSE)，并由此引起了熱激反應，從而激活該基因編碼轉錄合成HSP。最早發(fā)現(xiàn)熱激蛋白的產(chǎn)生是由高溫引起的，實際上能夠引起熱激反應的不僅是高溫，很多物理因素以及重金屬離子等外源物質和相關組織損傷等 ，總之那些能對細胞產(chǎn)生損傷的各種物理化學因素一般都是可以引起熱激反應的，產(chǎn)生了熱激蛋白 [2]。</p><p>　　1.

24、2熱激蛋白的分類</p><p>　　再目前，對于熱休克蛋白的分類較多用的是日本學者森本的劃分方法。這種方法將主要的HSP劃分為了4個家族：HSP90家族(分子質量約為83～90ku)，HSP70(分子質量約為66～78 ku)，HSP60以及小分子量的HSP家族(分子質量約為12～43 ku)。HSP70家族是最保守的熱休克蛋白家族，它在原核生物及真核生物體內都存在，并且存在于所有的細胞和器官中，幾乎在所有的生

25、物的應激細胞中都能夠被高度誘導，在熱休克蛋白中，HSP70是最為保守的一類，其擁有廣泛的生物學功能，這使其成為當今的研究熱點[3]。</p><p>　　1.3 HSP70家族</p><p>　　在絕大多數(shù)生物中，HSP70是含量最多的熱休克蛋白。HSP70蛋白具有許多共同的性質，這包括：所有的HSP70在與ATP的結合時，具有高親和力，并且具有微弱的ATPase活性；可以識別不同的靶多

26、肽并且調節(jié)它們的構象；需要其它的HSP或細胞因子輔助其行使功能；在細胞的適當部位折疊態(tài)蛋白的積累可以誘導個別HSP70家族成員的合成。HSP70具有高度的保守性，在真核生物中，HSP70蛋白具有60%~70%的保守性。大腸桿菌中的DnaK與真核生物中的HSP70具有40%~60%的同源性。氨基端部分具有ATP結合區(qū)和ATPase活性，這比羧基端部分具有更高的保守性。羧基端部分可能與一系列特殊蛋白底物作用，而氨基端部分與所有HSP70共同

27、的生化性質是有關的 [4]。</p><p>　　HSP70家族成員及其功能[4]</p><p>　　1.4 HSP70基因的轉錄調節(jié)</p><p>　　在哺乳動物細胞中的HSP70合成是一個自身調節(jié)的過程，包括HSP70與熱休克轉錄因子(HSF1)之間的相互作用。目前已鑒定出兩種種熱休克轉錄因子，HSF1介導應激誘導的熱休克基因轉錄， HSF2參與細胞分化和細

28、胞功能的其他過程。在非應激細胞中，HSF1是以單體的形態(tài)存在的，如果HSF1與HSP70相互反應，HSF1就具有了DNA結合能力。在熱休克期間，復性及非折迭的蛋白質濃度增加，而HSP70游離于HSF1之外，被釋放的HSF1聚積成三聚體，隨后進入細胞核，被磷酸化，結合熱休克元件(HSE)的熱休克基因啟動子區(qū)域。這些熱休克基因剛開始具有轉錄活性，導致了HSP70濃度增加。當合成到HSP70達到最佳濃度時，HSP70就與剛被激活的HSF1相互

29、作用，形成HSP70-HSF2復合物。在結合處，HSF1與DNA相互分離，轉變成了無活性，且未結合DNA的單體 [1]。</p><p>　　2 HSP70的功能</p><p>　　2.1 為分子伴侶的Hsp70</p><p>　　2.1.1 HSP70與分子伴侶</p><p>　　分子伴侶是指：能夠結合和穩(wěn)定另外一種蛋白質的不穩(wěn)定構象

30、，并能通過有控制結合和釋放，促進新生多肽鏈的折疊、多聚體的裝配或降解及細胞器蛋白的跨膜運輸?shù)鹊囊活惖鞍踪|。分子伴侶是在進化上非常保守的蛋白質家族，廣泛分布于各種生物體內。由于分子伴侶能夠防止未折疊蛋白質的變性和促進聚集的蛋白質的溶解復性，所以在細胞經(jīng)受高溫或其他脅迫時的作用是特別重要的，許多分子伴侶在生物體內首次以HSP(heat shock protein)形式被鑒定出來[5]。</p><p>　　2.1.2

31、 HSP70的結構</p><p>　　HSP70結構主要由一個N端高度保守的44 ku ATPase功能域(ATP binding domain)和一個分子質量為25 ku的C端區(qū)域組成 [8]。</p><p>　　HSP70的結構可分為三部分：44 kD部分(N端)，由4個 螺旋形成一個裂縫，是結合ATP的構域，有ATPase活性；18 kD部分，由4個反相平行的B折疊和一個螺旋構成

32、，是多肽的結合部位；10 kD部分(C端)，主要由螺旋構成，是活性調節(jié)區(qū)域。其C端具有EEVD這四個氨基酸序列，在HSP70和HSP90中都是高度保守的[5]。</p><p>　　2.1.3 作為分子伴侶的HSP70</p><p>　　分子伴侶可以幫助體內蛋白質的正確組裝，它可以抑制產(chǎn)生非功能結構的非正常折迭方式。一種蛋白質自發(fā)性折迭要比自身快得多，這說明了生多肽的折迭對與自身或其他蛋

33、白質的隨意結合極為易感。當一種蛋白質的拆迭區(qū)域在此蛋白合成過程中變得易感時，核糖體就離開此區(qū)域，并且出現(xiàn)分子內和分子間聚集。這些特點被認為是由于疏水殘基顯露出來所導致的。在蛋白質的重新折迭過程中，一個非常常見的錯誤是錯誤折迭和聚集。這種現(xiàn)象在體內極少發(fā)生，除非在溫度升高時發(fā)生蛋白質突變。研究已證實新生多肽在體外折迭是無效的，而體內折迭有效率通?？梢赃_到100％。因此可以判斷體內多肽在合成過程中受到了保護，從而避免了錯誤折迭和聚集的發(fā)生。

34、這種保護是受分子伴侶控制的，分子伴侶與之結合，并保護了有活性的蛋白質表面，預防蛋白質折迭的發(fā)生。HSP70具有結合肽類的能力，并且在HSP70的ATP酶活性較低時，在合成整個蛋白質分子或者在蛋白質分子進入一個細胞器過程中與一個新生肽鏈發(fā)生了聯(lián)系，避免錯誤折迭和聚集發(fā)生[1]。</p><p>　　2.1.4 HSP70分子伴侶系統(tǒng)</p><p>　　HSP70具有多種生物學功能，主要是由

35、于它能夠以依賴于ATP的方式結合或者釋放非天然構象多肽的疏水片段，并且能遮蔽這些片段穩(wěn)定蛋白質的松弛構象和阻止聚集。HSP70不能獨自起作用，其依賴于co-chaperone的調節(jié)作用．在相關研究中發(fā)現(xiàn)，DnaJ可以提高HSP70的ATPase活性和促進其與底物的結合。例如E.coli DnaK有兩個co-ehaperone：DnaJ和GrpE。DnaJ是41 ku的熱休克蛋白(HSP40)，可以為DnaK提供蛋白質底物和促進其ATPa

36、se活性。而GrpE是22 ku的熱休克蛋白(HSP20)，可以通過ADP和ATP的交換啟動多肽的釋放，故GrpE又被叫做核苷酸交換因子。DnaJ家族成員廣泛存在于原核生物和真核生物中HSP70存在的區(qū)域。在真核生物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種DnaJ—like，有些(如SEC63和Tim44)是以膜結合的形式存在的，有些則以溶解的形式存在于細胞質和線粒體基質中。但是GrpE類似物(如Mge1)只是在真核生物的線粒體中被發(fā)現(xiàn)。</p>

37、<p>　　2.2 HSP70的抗原遞呈作用</p><p>　　HSP70具有結合到細胞內產(chǎn)生的抗原多肽上的功能。這是內源性抗原遞呈的一部分，將導致CD8+T細胞的激活。結合有HSP70的多肽釋放到細胞外時或HSP-肽復合物在體外存在時，復合物將會通過受體介導的內吞作用被當作疫苗被抗原遞呈細胞如巨噬細胞和樹突狀細胞等吸收。這些HS-肽復合物將會經(jīng)過存在于巨噬細胞和樹突狀細胞表面的MHC-I類分子遞呈

38、到T淋巴細胞，這個過程被稱作交叉遞呈作用。和單獨的抗原遞呈作用相比，HSP-肽復合物可以誘導更強的T細胞活化作用[6]。</p><p>　　2.3 HSP的抗凋零作用</p><p>　　凋亡(序列細胞死亡)是一個主動過程，其特征性形態(tài)變化包括：核濃縮，核糖體之間DNA裂解及膜產(chǎn)生氣泡。斷裂的染色質和膜結合的染色質可以被鄰近細胞所吞噬，而且沒有炎癥應答反應過程。</p>&

39、lt;p>　　最近一項研究發(fā)現(xiàn)，HSP72可以通過調節(jié)Caspase途徑來抑制熱應激所誘導的凋亡，盡管它在抗離子化輻射方面使無效的。同樣，對小鼠精母細胞特異性HSP70基因進行指定性破壞可以導致精母細胞凋亡的增加。在已證明抗雕亡蛋白質BAG-1是HSP70和HSC70的調節(jié)子情況下，證明了HSP70s進一步參與細胞死亡的抑制。Hsp70的抗凋亡功能部分是通過抑制ICE樣Caspases來實現(xiàn)的，BAG-1可與Hsp70在這些過程中

40、相互合作[1]。</p><p>　　2.4 HSP是與微管有關的蛋白質</p><p>　　與微管有關的蛋白質(MAPs)可以被分為二種：動力型MAP s，它可以把微管做為細胞內路徑亞細胞結構發(fā)生易位，如膜結合性囊泡，內質網(wǎng)元件，線粒體和染色體等；結構型MAPs，它起到一種建筑作用，調節(jié)微管的空關組成，因而影響他們的功能。就是這后一種方式，表示了HSP70的特點。HSP70移附在聚合微管

41、蛋白的羧基末端(尤其在431～444殘基處)，此部位具有MAP s識別的位點，HSP70被看作為微管蛋白聚合作用的調節(jié)因子。HSP70作為MAPs(又能夠促進微管蛋白的組裝和穩(wěn)定)的拮抗劑可抑制微管形成，F(xiàn)Isp70也可通過破壞MAPs來問接促進微管蛋白組裝。HSP70也可以穩(wěn)定細胞骨架蛋白如肌動蛋白。[1]</p><p>　　2.5HSP是一種應激保護質</p><p>　　HSP70

42、是熱應激和其他應激所誘導出的最為顯著的蛋白質之一。HSP的誘導往往與對其他應激耐受性的誘導有關。多數(shù)應激，由于暴露了蛋白質的隱蔽性疏水區(qū)而使蛋白質的結構完整性協(xié)調化。Hsp70s結合這些被損傷的蛋白質，可預防它們發(fā)生聚集。HSP70不僅可以預防胞漿內蛋白質發(fā)生聚集而且還可以遷徙到核仁中，與部分組裝的核糖體建立聯(lián)系，從而保護細胞核。用一種部分折迭構象把損傷蛋白質穩(wěn)定住可以為這些損傷蛋白質的重新折迭起來或降解提供機會。HSP70蛋白質還在耐

43、熱上起作用。耐熱通常被定義為通過先接觸輕度高溫后，忍受嚴重高溫的能力，各種觀察結果證實了HSP70在耐熱方面的作用。例如，耐熱的誘導與HSP70的積累之間關系要比與其他熱休克蛋白之間的關系更為密切。向接觸45℃ 的成纖維細胞中顯微注射HSP70抗體可以阻止此類細胞存活，而對照性抗體，則無此作用。通過高溫處理，篩選耐熱細胞系列可以生產(chǎn)出過分表達HSP70蛋白的細胞。用HSP70 mRNA顯微注射小鼠卵母細胞，隨后讓卵母細胞接觸高溫，結果發(fā)

44、現(xiàn)實驗組卵母細胞的受精率和發(fā)育狀況明顯高于對照組。[1]</p><p>　　3HSP在治療人類疾病中的作用</p><p>　　3.1HSP70在腫瘤免疫反應中的作用</p><p>　　在1943～1962年間，人們發(fā)現(xiàn)大鼠用滅活的腫瘤細胞接種后，能夠對隨后的活腫瘤細胞的進攻產(chǎn)生免疫力，并且這種滅活的腫瘤細胞只對同源的腫瘤起免疫反應，而對其它腫瘤不應答。80年代

45、初，在從腫瘤細胞成分中純化腫瘤排斥抗原的過程中發(fā)現(xiàn)HSPs參與了腫瘤免疫，已發(fā)現(xiàn)HSP70，Gp96和HSP90參與該過程。</p><p>　　在研究過程中，研究人員先以電泳分析腫瘤細胞的蛋白質譜，試圖比較腫瘤細胞與正常細胞的蛋白質譜之間的不同而找到能產(chǎn)生免疫應答的組分，但是一無所獲。而后，研究人員又以功能分離法，將腫瘤細胞抽提物逐步細分，追蹤能產(chǎn)生免疫應答的組分，發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生免疫應答的組分是HSPs。可是，比較

46、腫瘤細胞與正常細胞HSP的序列卻發(fā)現(xiàn)兩者幾乎完全一致。繼續(xù)深入研究發(fā)現(xiàn)，與HSP結合的小肽才是產(chǎn)生免疫應答的關鍵。</p><p>　　Tamura等在1997將3LLcarcinoma的一株高轉移的細胞株D122，注射人小鼠足墊中，正常的結果是一段時間后(11天)將在其肺部發(fā)現(xiàn)轉移的腫瘤。以D122的GP96制備物治療小鼠，小鼠轉移的腫瘤數(shù)目明顯減少，而若用其它3LL carcinoma細胞株的GP96制備物治

47、療小鼠，則沒有明顯效果。這說明HSPs治療方法有個體專一性。他們使HSP70與ATP結合，放出HSP70結合的小肽后對腫瘤的免疫功能幾乎完全丟失，證明了HSPs實際上只起了載體的作用，與之結合的小肽才是關鍵。另外Tamura等還對一些缺陷型小鼠實驗，表明HSPs對腫瘤的免疫應答必須依賴CD4 T細胞，CH8 T細胞，NK細胞和巨噬細胞[9]。</p><p>　　3.2 HSP70參與腫瘤免疫應答的分子機制<

48、;/p><p>　　3.2.1 MHC-I途徑</p><p>　　胞質溶液中抗原經(jīng)蛋白酶體降解后，抗原肽片斷經(jīng)HSP70、HSP90以依賴ATP方式結合并轉運至內質網(wǎng)膜上的抗原處理相關轉運蛋白(TAP)，再經(jīng)TAP轉運至內質網(wǎng)腔內，由GP96轉運。在此過程中肽分子經(jīng)胞質溶膠及內質網(wǎng)腔中的多種外肽酶依次進行修剪，直至適合MHC-I類分子肽結合槽，形成穩(wěn)定的三聚體。然后MHC-I呈遞抗原肽至細胞

49、表面，但是由于宿主對腫瘤細胞的免疫耐受，這時并不能真正引起免疫應答。只有當腫瘤細胞的HSPs制備物被注射如宿主體內時，HSP一肽通過巨噬細胞表面的專一受體進入巨噬細胞(不同于溶酶體方式)，一方面誘導巨噬細胞分泌IL-1、IL-2、TNF-d和IFN等細胞因子激活各種效應細胞殺傷腫瘤；另一方面由于抗原的呈遞效果在巨噬細胞表面得到增強，可以為CD8 T細胞識別，于是引起免疫應答。在巨噬細胞表面已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了GP96的特異受體CD91，對這個機理

50、是一種佐證[10]。</p><p>　　某些HSP70分子(如PBP74)可以替代MHC分子，與抗原結合后，呈遞于細胞表面。吳偉忠等曾用表面缺乏MHC-I類分子表達的H22細胞熱休克后與淋巴細胞單向混合培養(yǎng)后所誘導的CTL能增加對同種熱休克腫瘤細胞的殺傷作用，但這種殺傷作用可被抗小鼠HSP70IgG2a單抗所阻斷，表明效應細胞對靶細胞的殺傷作用是通過識別靶細胞膜上的HSP70介導的，而不是通過MHC-I類分子介

51、導的。進一步分析效應細胞的CD4、CD8及TCR表型發(fā)現(xiàn)，誘導細胞中特異性殺傷作用的CTL表型為CD8- CD4- TCRγδ+ 的淋巴細胞。由此可見，HSPs可作為γδT細胞識別的抗原配體，在γδT細胞的動員、增殖和生物學活性的發(fā)揮中起著極其重要的作用 [11]。</p><p>　　3.2.2 MHC-II途徑</p><p>　　HSPs轉運抗原肽可以進入內質體，并且協(xié)助抗原肽與MH

52、C—I1分子結合，遞呈抗原肽至細胞表面。這一機理只是推測，并無直接證據(jù)證明[2]。</p><p>　　3.3嵌合DNA疫苗HSP70</p><p>　　3.3.1嵌合DNA疫苗</p><p>　　嵌合DNA疫苗是將幾個不同的抗原蛋白基因或抗原蛋白基因與編碼細胞因子、共刺激分子等具有免疫佐劑效應的分子基因共同嵌合于一個真核表達質粒，以增強抗原特異性免疫反應。研究

53、證明嵌合DNA疫苗通過嵌合優(yōu)于普通DNA疫苗與佐劑聯(lián)合免疫，提高了免疫保護性，減少了毒副作用。它具有以下優(yōu)點：(1)只含部分基因組序列，減少了變態(tài)反應，不會因其毒力回升或滅活失敗而導致疫苗病例，不含有活疫苗制劑經(jīng)常含有的培養(yǎng)基、血清等外源成分的污染，可在新生兒及免疫功能低下人群中應用，免疫人群的范圍擴大；(2)抗原既能引起體液免疫又能引起細胞免疫，效果類似減毒活疫苗；(3)制備簡單，成本低，易進行規(guī)?；a(chǎn)；(4)構建周期短，利于對病原

54、抗原變異作出快速反應；(5)外源容量大，易發(fā)展為多價疫苗；(6)儲存簡單，保存期長，無需冷鏈，易在不發(fā)達的國家推廣。</p><p>　　3.3.2 嵌合DNA疫苗HSP70</p><p>　　自研究證實HSPT0在動物和人類具有抗感染及抗腫瘤效應以來，有關嵌合DNA疫苗HSPT0的研究不斷深入。在預防及治療細菌、病毒、寄生蟲等感染以及腫瘤等方面獲得了明顯進展。</p>&

55、lt;p>　　3.3.2.1抗感染作用</p><p>　　1995年，Lowrie等將結核分枝桿菌HSP70抗原克隆到了巨細胞病毒啟動子下構成了DNA疫苗，發(fā)現(xiàn)其免疫效果與BCO非常相近。另外結核分枝桿菌HSP70-CD80、HSP70-Ag85A等改進的嵌合DNA疫苗在實驗中都顯示了有較好的免疫效果，給了免疫低下患者或缺陷患者以及耐藥結核病患者帶來了希望。[12]</p><p>

56、;　　1996年，suzue使用結核分枝桿菌HSP70和HIV-lp24嵌合的表達質粒免疫小鼠，結果證明比OVA與HIV-1p24嵌合的表達質粒和HIV-1p24表達質粒的免疫效果明顯增強。進一步的研究證明了OVA與HSP70融合蛋白不僅能夠刺激CD8+T細胞反應，還能夠刺激CD4-非依賴性CTL應答，為CD4+細胞缺乏患者，如艾滋病患者的預防和治療帶來了希望。[13]</p><p>　　2000年，Maran

57、on等報道了使用克魯斯錐蟲HSP70與KMP11嵌合DNA疫苗，使用肌內注射感染小鼠，發(fā)現(xiàn)了單核細胞可釋放表達KMP11-HSP70融合蛋白，并且使未感染細胞發(fā)生交叉反應，促進DC成熟和Th1細胞的分化，分泌細胞因子，顯著提高細胞免疫與體液免疫能力。在小鼠中可有效預防及治療克魯斯錐蟲病。</p><p>　　3.3.2.1抗腫瘤作用 </p><p>　　2000年，Chen等建立了人乳

58、頭瘤病毒(HPV-16)E7抗原基因與結核分枝桿菌HSP70基因的嵌合DNA疫苗，而且在研究中發(fā)現(xiàn)E7-HSP70嵌合DNA疫苗的E7特異性CD8+T細咆明顯增高，是未嵌合的E7DNA疫苗的30倍，這證明了HSP70基因與抗原基因的嵌合可以顯著增強DNA疫苗的免疫保護效果。Hsu等以pSCA1為載體，發(fā)現(xiàn)HPV。l6E7抗原基因與結核分枝桿菌HSP70基因的嵌合DNA疫苗產(chǎn)生的T細胞誘導的免疫反應，顯著高于末嵌合的DNA疫苗，進一步證明

59、了HSP70可以增強免疫效果的功能0。Liu等以腺相關病毒(AAV)為載體也構建了HPV。l6E7與HSP70嵌合DNA疫苗，結里顯示了該疫苗可誘導CD4和CD8依賴性CTL活性，也可抑制同源表達E7的腫瘤細胞。HPV-l6E7-HSP70嵌合DNA疫苗已經(jīng)進行了臨床I／Ⅱ期試驗，用來治療HPV-l6相關的頸部高分化上皮鱗癌、頭頸部鱗細胞癌，證明治療確實有效，并與通常的肌肉注射法生物介導法相比較，用基因槍導入法可用最小的劑量產(chǎn)生最高數(shù)量

60、的E7特異性CD8+T細胞，產(chǎn)生最佳抗腫瘤效果。</p><p>　　由于腫瘤細胞的異質性，腫瘤組織來源的HSP70可以作為一種腫瘤特異性抗原，能夠誘導體內CD8+T淋巴細胞成為腫瘤特異性的CTL，并使Th1型細胞因子升高，具有特異性的抗腫瘤作用。在Vanaja等的研究中發(fā)現(xiàn)，患者腫瘤細胞表達的HSP70是腫瘤表面的特異性結構，與抗腫瘤活性有密切相關的關系。傅慶國等研究也證實腫瘤組織來源的HSP70 DNA疫苗有

61、很強的殺瘤活性，該疫苗在停止治療后仍可在較長時間內維持免疫作用，這個發(fā)現(xiàn)對于防止腫瘤復發(fā)、延緩腫瘤進展有重要意義。2003年，Cheng等研究證明，癌癥的免疫療法面臨的主要障礙是MHCI工類分子的低表達。由于腫瘤可使MHC工類分子低表達，因此建立MHCI類分子低表達的腫瘤模型是設計研制抗腫瘤疫苗的關鍵。該實驗用建立的低標準表達MHC I類分子腫瘤模型，證明了E7-HSPT0 DNA疫苗可對MHC I類分子低表達的腫瘤產(chǎn)生顯著的抗腫瘤效應

62、，但是牛痘疫苗卻不能產(chǎn)生相似的抗腫瘤效應。在同時淋巴細胞損耗實驗證明了CD8+T細胞、NK細胞、IFN-γ是應用疫苗時產(chǎn)生抗腫瘤效應所必須的成分。在另外一些報道中，HSP110-腫瘤抗原肽復合物是無MHC I類抗原</p><p><b>　　問題與展望</b></p><p>　　盡管HSP70分子伴侶系統(tǒng)結構和功能方面的研究取得了很大的進展，但是在DnaJ-lik

63、e為HSC70提供蛋白質底物的機理方面，特別是對真核生物HS00而言還不清楚。另外ATP與HSP70ATPase功能域的結合和水解如何引起底物結合功能域構象發(fā)生變化的機理仍然不知道。如何搞清楚這些問題，對于闡明蛋白質的折疊、定位及跨膜運輸機理是有重要意義的.</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 李守軍, 王洪斌. Hsp70研究進

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73、t;p>　　[21] 趙永亮, 余佩武, 蔡志民. 熱休克蛋白70在肝細胞癌中的表達及其意義[J]. 免疫學雜志, 2002, 18(1):64.</p><p>　　[22] 陳亞瓊, 熱激蛋白與生物環(huán)境適應及進化的關系[J]. 自然科學進展, 2006, 16(9):1066-1073.</p><p>　　[23] 王秋香, 李宗蕓, 謝艷, 等. 果蠅熱激蛋白的研究進展[J]

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75、;<p>　　[26] 祝璟琳, 王國良. 魚類HSP70的研究進展[J]. 寧波大學學報, 2007, 20(4): 446-450.</p><p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　　（20_ _屆）</b></p><p>　　納米TiO2對斑馬魚肝損傷基因表達的影響<

76、/p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　1 引言2</b></p><p><b>　　2 材料與方法3</b></p><p>　　2.1 實驗材料3</p><p>　　2.1.1 動物材料1</p>&

77、lt;p>　　2.1.2 主要試劑1</p><p>　　2.1.3 主要設備3</p><p>　　2.2 實驗方法3</p><p>　　2.2.1 斑馬魚的馴養(yǎng)3</p><p>　　2.2.2 斑馬魚的染毒處理4</p><p>　　2.2.3 斑馬魚總RNA的提取4</p>&

78、lt;p>　　2.2.3.1 使用Biozol試劑提取RNA4</p><p>　　2.2.3.2 總RNA完整性檢測4</p><p>　　2.2.3.3 總RNA濃度及純度分析4</p><p>　　2.2.4 RT-PCR擴增4</p><p>　　2.2.4.1 RT-PCR反應體系4</p><p

79、>　　2.2.4.2 PCR反應條件5</p><p>　　2.2.4.3擴增產(chǎn)物的檢測6</p><p>　　2.3 數(shù)據(jù)處理6</p><p><b>　　3 結果6</b></p><p>　　3.1 斑馬魚肝總RNA完整性檢測6</p><p>　　3.2 總RNA的濃度及

80、純度檢測7</p><p>　　3.3 納米TiO2對各基因表達的影響7</p><p>　　3.3.1 納米TiO2對ACTIN基因表達的影響7</p><p>　　3.3.2 納米TiO2對CTR1基因表達的影響8</p><p>　　3.3.3 納米TiO2對MTF-1基因表達的影響9</p><p>

81、　　3.3.4 納米TiO2對NKA基因表達的影響10</p><p>　　3.3.5 納米TiO2對HSP70基因表達的影響11</p><p>　　3.3.6 納米TiO2對HIF基因表達的影響12</p><p>　　4 分析與展望13</p><p>　　4.1 納米TiO2對斑馬魚肝CTR1基因表達影響的機理分析13<

82、;/p><p>　　4.2 納米TiO2對斑馬魚肝MTF-1基因表達影響的機理分析13</p><p>　　4.3 納米TiO2對斑馬魚肝NKA基因表達影響的機理分析14</p><p>　　4.4 納米TiO2對斑馬魚肝HSP70基因表達影響的機理分析14</p><p>　　4.4 納米TiO2對斑馬魚肝HIF基因表達影響的機理分析1

83、5</p><p><b>　　4.5 展望15</b></p><p><b>　　參考文獻16</b></p><p>　　摘要：為探討納米TiO2（Nano-TiO2）顆粒對斑馬魚（Danio rerio）肝損傷相關基因表達的影響，選取濃度為5.6mgL-1的 TiO2培養(yǎng)斑馬魚，運用半定量RT-PCR技術分析相

84、關基因在不同處理時間（6h，12h，24h，48h，72h）的表達量。共檢測了HSP70（heat shock protein，熱休克蛋白）、HIF (hypoxia inducible factor，低氧誘導因子)、CTR1（copper transporter 1，銅離子轉運蛋白）、MTF-1（metal-responsive transcription factor-1，金屬調節(jié)轉錄因子）、NKA（Na+-K+-ATPase，鈉鉀

85、ATP酶）。實驗結果顯示，納米Ti02對CTR1基因的表達影響不顯著，而對其他相關基因表達有著較明顯的影響，并且對不同基因的表達的影響呈多樣性。本研究旨為深入研究魚類基因表達與重金屬解毒分子機制間的關系，以及為研究納米材料毒理奠定基礎。</p><p>　　關鍵詞： 納米TiO2；肝損傷；基因表達</p><p>　　Abstract: To investigate the express

86、ion of zebra fish (Danio rerio) gene related to liver injury under the influence of Nano-TiO2 particles. Using Nano-TiO2 particles with concentration of 5.6mg·L-1 to feed zebra fish and Using Semi-quantitative RT-PC

87、R technology to analysis the expression of associated genes in different time (6h, 12, 24h, 48h, 72h). In total, HSP70 (heat shock protein), HIF (hypoxia inducible factor), CTR1 (copper transporter 1), MTF-1(metal-respon

88、sive transcription factor-1) </p><p>　　Keywords: Nano-TiO2; liver injury; gene expression</p><p><b>　　1 引言</b></p><p>　　納米是英文namometer的譯音，是一個物理學上的度量單位，1納米是1米的十億分之一，相當于45

89、個原子排列起來的長度。當物質到達納米尺度以后，大約是在1～100納米這個范圍內，物質的性能就會發(fā)生突變，出現(xiàn)特殊性能。這種具不同于原來組成的原子、分子，也不同于宏觀的物質的特殊性能所構成的材料，即為納米材料[1]。</p><p>　　納米TiO2（Nano-TiO2，簡稱n-TiO2）作為應用廣泛的納米材料之一，其應用范圍從民眾日用品牙膏，防曬霜到工業(yè)品如油漆、涂料、傳感器以及污水處理等眾多領域[2]。納米Ti

90、O2的加入，對原物質的理化性質也會產(chǎn)生很大的影響[3]，所以，隨著對納米材料研究的深入，應用范圍在不斷拓寬，對人類的影響也在日益擴大。</p><p>　　隨著納米TiO2被不斷的應用于相關產(chǎn)業(yè)，其對人類造成的危害也凸顯了出來。在一些研究中發(fā)現(xiàn)，納米TiO2對生物肺上皮細胞所產(chǎn)生的細胞毒性影響是比較嚴重的，可以導致各種心血管與呼吸道疾病[4]。</p><p>　　斑馬魚（Danio re

91、rio）又名藍條魚、花條魚、斑馬擔尼魚，是一種熱帶觀賞魚，屬鯉科短擔尼爾屬。原產(chǎn)于印度、孟加拉國[5]。斑馬魚容易獲得，易于飼養(yǎng)，生殖周期短，繁殖能力強，結構簡單，基因組和其它許多方面都與人類有著極大的相似性。斑馬魚的特點使其在20世紀70年代開始受到科學家們的關注，并成為最重要的模式脊椎動物之一[6]。</p><p>　　目前對生物體內組織損傷相關基因的研究取得了很大的進展。如HSP70（heat shock

92、 protein 70，熱休克蛋白70），它是一組廣泛存在于微生物和動植物體內的生物進化中高度保守的多肽蛋白。由于此類蛋白的合成與熱休克反應有關，所以命名為熱休克蛋白（heat shock protein）。除高熱之外，多種應激原如重金屬、饑餓、缺氧缺血等都可以誘導HSP的表達[7]。</p><p>　　HIF (hypoxia inducible factor，低氧誘導因子)，是一種分布和作用十分廣泛的真核細

93、胞轉錄因子，可以被多種胞外刺激活化、上調影響細胞存活、生長分化以及凋亡的基因表達，具有重要的生理和病理作用。今年來，由于人為地向水體中排放過量的營養(yǎng)物質和有機物質，水體富營養(yǎng)化嚴重，導致缺氧現(xiàn)象頻繁發(fā)生。HIF作為低氧相關基因調控中重要的核心轉錄因子已經(jīng)成為相關研究中的重點[8]。</p><p>　　CTR1（copper transporter 1，銅離子轉運蛋白），CTR1蛋白是銅離子攝入蛋白，是銅進入細胞

94、的關鍵運輸工具，其表達量的多少直接關系到機體銅代謝的平衡[9]。相關研究表明，CTR1可能與機體其他金屬代謝平衡有一定關系[10]。</p><p>　　此外，MTF-1（metal-responsive transcription factor-1，金屬反應轉錄因子）和NKA（Na+-K+-ATPase，鈉鉀ATP酶）都是細胞損傷相關蛋白，在細胞損傷調控機制中有著很重要的地位[11]。</p>&

95、lt;p>　　盡管對魚類，人類腫瘤細胞中的相關基因的表達與調控已經(jīng)有了深入的研究，證明了相關基因的重要作用及調控過程[12]。但是對于納米材料對生物組織損傷相關基因表達的報道尚不多。斑馬魚作為一種重要的模式生物，研究納米TiO2對其肝損傷相關基因的表達是有非常重要的意義的。本實驗以藍色斑馬魚作為實驗材料，采用one-step RT-PCR技術檢測斑馬魚肝損傷相關基因的表達。本實驗的結果不僅可以為斑馬魚肝損傷相關基因表達的分子機制提

96、供參考，還可以為納米材料對生物的傷害研究提供一定的依據(jù)，具有重要的理論和實際意義。</p><p><b>　　2 材料與方法 </b></p><p><b>　　2.1 實驗材料</b></p><p>　　2.1.1 動物材料</p><p>　　斑馬魚（Danio rerio），購自寧波天勝

97、花鳥市場，體型大小相似，長約3.5cm，健康，活力正常。</p><p>　　2.1.2 主要試劑</p><p>　　納米TiO2：購于杭州大洋納米新材料有限公司；</p><p>　　Bizol RNA提取試劑盒：購于上海生工生物工程技術服務有限公司；</p><p><b>　　異丙醇；</b></p>

98、<p><b>　　氯仿（三氯甲烷）；</b></p><p><b>　　75%乙醇；</b></p><p>　　TaKaRa PrimeScript@ One Step RT-PCR Kit Ver.2: 購于寶生物工程（大連）有限公司；</p><p>　　Ribonuclease Inhibitor

99、（核糖核酸酶抑制劑）；</p><p><b>　　DEPC-H2O；</b></p><p>　　KMnO4（高錳酸鉀）；</p><p>　　DNA Marker，6×Loading Buffer：購于寶生物工程（大連）有限公司。</p><p>　　2.1.3 主要設備</p><p&

100、gt;　　SW-CJ-3FD型雙人單面凈化工作臺；</p><p>　　裝備控溫裝置及充氣的魚缸；</p><p>　　NEOFUGE-15R型高速冷凍離心機；</p><p>　　AB104-N型電子分析天平；</p><p><b>　　超聲波振蕩儀；</b></p><p>　　JunYi

101、600+雙控電泳儀；</p><p>　　PX2 Thermal Cycler PCR自動分析儀；</p><p><b>　　液氮罐；</b></p><p>　　Alpha Imager 2200凝膠圖像處理系統(tǒng)；</p><p>　　Thermo nanoDrop 1000超微量分光光度計。</p>

102、<p><b>　　2.2 實驗方法</b></p><p>　　2.2.1 斑馬魚的馴養(yǎng)</p><p>　　將購買來的斑馬魚在去氯離子水中馴養(yǎng)。調節(jié)魚缸內溫度為28℃左右，于每天09:00和17:00按斑馬魚體重的5%-10%的量投放飼料。調節(jié)投放飼料量以使斑馬魚健康的生長。2-3天換水一次，每次大約換去缸內2/3的水。每天觀察并作記錄，檢查缸內溫度及充

103、氣裝備是否正常，清潔魚缸。</p><p>　　2.2.2 斑馬魚的染毒處理</p><p>　　馴養(yǎng)兩周后，取25尾大小相似，身體健壯的斑馬魚，投放于放有20L去氯離子水的魚缸中飼養(yǎng)。稱取0.112g的納米TiO2顆粒，放于燒杯中。用200ml的去氯離子水溶解，置于超聲波振蕩儀中振蕩約30min后觀察。若TiO2顆粒均勻的分散于溶液中，溶液顏色均勻，燒杯底部無沉淀。將溶液倒入魚缸中，對斑

104、馬魚進行染毒處理。染毒時間持續(xù)72h，在第6h，12h，24h，48h，72h各取5尾魚，提取斑馬魚肝放入液氮中凍存，備用。</p><p>　　2.2.3 斑馬魚總RNA的提取</p><p>　　2.2.3.1 使用Biozol試劑提取RNA</p><p>　　按照試劑盒操作說明書進行操作：</p><p>　　將提取的肝組織在已用液氮

105、預冷的研缽中研磨，直至組織被研磨至粉末。將1ml的Bizol加入研缽中進行裂解。</p><p>　　將裂解液靜置約30min，待裂解液完全溶化后，用RNA專用槍頭吸入EP管中，在室溫下放置15-20min。</p><p>　　加入200ul的氯仿，蓋緊管蓋，劇烈震蕩混勻30s。再于冰上孵育15min。臺式高度冷凍離心機上，于4℃，12000r/min條件下離心15min。RNA存在于離

106、心后混合物的上清層中。將上清液轉移至1.5ml EP管中，加入等體積冰浴的異丙醇，緩慢混勻，用以沉淀RNA。</p><p>　　將樣品在-20℃條件下孵育20min以上。臺式高速冷凍離心機上，以4℃，12000r/min條件離心10min。RNA沉淀膠狀形成于管底或者管壁上。</p><p>　　小心棄去上清液，防止RNA沉淀丟失。用冰浴的75%的乙醇洗滌兩次，顛倒洗滌管壁，漩渦振蕩樣品

107、。使RNA沉淀懸浮。4℃，12000r/min下離心5min，小心棄去上清液，防止RNA沉淀丟失。晾干RNA沉淀。</p><p>　　用50ul DEPC-H2O溶解沉淀，并加入0.5ul的RNA酶抑制劑。放于-40℃冰箱保存。</p><p>　　2.2.3.2 總RNA完整性檢測</p><p>　　采用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性。取5ul已處理好的總R