畢業(yè)論文家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑基因serpin-2的克隆、序列分析及表達

1、<p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　摘要1</b></p><p><b>　　前言3</b></p><p><b>　　1 材料和方法3</b></p><p>　　1.1 材料及主要試劑4<

2、;/p><p><b>　　1.2 方法4</b></p><p>　　1.2.1 引物設計4</p><p>　　1.2.2 PCR擴增目的片段4</p><p>　　1.2.3 目的片段的分離和回收（Takara回收試劑盒）5</p><p>　　1.2.4 酶切反應5</p>

3、;<p>　　1.2.5 連接反應5</p><p>　　1.2.6 感受態(tài)細胞制備6</p><p>　　1.2.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化6</p><p>　　1.2.8 試劑盒抽提質(zhì)粒DNA6</p><p>　　1.2.9 重組質(zhì)粒的鑒定及測序6</p><p>　　1.2.10 原核表達7

4、</p><p>　　1.2.11 SDS-PAGE蛋白電泳7</p><p><b>　　2 結(jié)果8</b></p><p>　　2.1 野桑蠶Serpin-2基因的cDNA序列克隆8</p><p>　　2.2 野桑蠶Serpin-2基因的cDNA序列分析9</p><p>　　2.3

5、 Serpin-2重組表達載體酶切鑒定12</p><p>　　2.4 蛋白質(zhì)表達與SDS-PAGE分析13</p><p>　　2.5 Western Bloting分析錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　3 討論14</b></p><p><b>　　參考文獻：15</b>

6、;</p><p><b>　　致 謝16</b></p><p><b>　　附錄1.19</b></p><p><b>　　附錄2.20</b></p><p>　　家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑基因serpin-2的克隆、序列分析及表達</p><p

7、><b>　　摘 要</b></p><p>　　本研究以家蠶中大造品種為材料，以其 cDNA為模板克隆家桑蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑Serpin-2基因；采用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)（BL21）進行家蠶Serpin-2基因的表達研究。主要結(jié)果如下：</p><p>　　根據(jù)已知野蠶Serpin-2（GenBank登錄號：AF242200.1）序列設計合適的引物，采用

8、PCR方法克隆了家蠶Serpin-2基因。序列分析表明，家蠶Serpin-2基因編碼區(qū)長度為990bp，編碼329個氨基酸，相對分子量約為43.75 kDa，等電點約為4.67。與家蠶Serpin-2比較發(fā)現(xiàn)，兩者基因序列相似度高達99.29%，氨基酸序列相似度高達98.93%，推測家蠶Serpin-2與野桑蠶Serpin-2基因起著相同或類似的作用。</p><p>　　將家蠶大造Serpin-2基因克隆進原核

9、表達載體pET-28a(+)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導蛋白質(zhì)表達。SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明，經(jīng)IPTG誘導轉(zhuǎn)化家蠶Serpin-2的BL21菌與對照BL21菌、空pET-28a(+)轉(zhuǎn)化BL21菌相比出現(xiàn)了一條特異性的蛋白質(zhì)條帶，相對分子量約44 kDa，與預計的大小相符，證實家蠶Serpin-2在大腸桿菌中得到表達。</p><p>　　家蠶Serpin-2基因的成功克

10、隆和原核表達研究為從分子水平上解析Serpin在野桑蠶體內(nèi)的功能打下了基礎。</p><p>　　關鍵詞：家蠶；Serpin-2；基因克隆；原核表達</p><p>　　Cloning and prokaryotic expression of Serpin-2 gene of Bombyx mori</p><p><b>　　Abstract</

11、b></p><p>　　In this study，the gene of Serpin in Bombyx mori (Serpin-2) was cloned by PCR using the whole body cDNAs as templates. E.coli prokaryotic expression system was used for expression study of serp

12、in-2 gene. The main results are as follows:</p><p>　　According to the sequence of Bombyx mandarina serpin-2 gene, proper primer was designed and Serpin-2 gene of Bombyx mori（The GenBank accession numbers：AF2

13、42200.1）was cloned by PCR. According to sequence analysis, the 990bp coding region of Serpin-2 encoding 329 amino acid residues results in theoretical molecular weight of 43.75 kDa, isoelectric point of 4.67. Comparied t

14、o the Serpin-2 gene of Bombyx mori and Bombyx mandarina，the gene identity and amino acid identity reach 98.7%，respectively. It</p><p>　　The Serpin-2 gene was constructed to the prokaryotic expression vector

15、pET-28a（+） and then transformed into E. coli BL21(DE3). And 1mmol/L IPTG was used to induce the target protein to express. SDS-PAGE analysis indicated that there was a specific band with relative molecular weight of 44 k

16、Da on PAGE profiles for the BL21 with Serpin-2 induced by IPTG, comparied to the contract BL21 and BL21 with empty pET-28a(+)，which confirmed that the Serpin-2 gene was successfully expressed. </p><p>　　The

17、successful cloning and prokaryotic expressing research of Serpin-2 gene in Bombyx mori has established the foundation for analying the fuction of Serpin in Bombyx mori.</p><p>　　Key words: Bombyx mandarina;

18、Serpin-2; cloning; prokaryotic expression</p><p><b>　　前 言</b></p><p>　　絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serine protease inhibitor, Serpin）是一族由古代抑制劑趨異進化5億年衍變而來的結(jié)構(gòu)序列同源的蛋白酶抑制劑，是一種球狀蛋白，并且各種Serpins大約有30％的序列同源

19、性，疏水區(qū)同源性高達70％[2]。目前，大約已有500 種Serpins 在動物、微生物、病毒和植物中得到鑒定（Irving JA， et al.， 2000）。 由350至500個氨基酸組成并且有著高度保守的三級結(jié)構(gòu)[3]。該抑制劑已陸續(xù)在真核生物，細菌和病毒中得到鑒定，而其超家族很多成員也被鑒定存在于病毒、植物和動物細胞組織中，而這些成員中大多數(shù)都是從哺乳動物血漿中分離的，它們大多與凝血過程有關[4]。絲氨酸蛋白酶抑制劑通過調(diào)節(jié)一

20、系列絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸酶的活性而參與了許多基本的生命活動[3]，已經(jīng)被廣泛應用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和食品等行業(yè)，對昆蟲的生命活動也至關重要。</p><p>　　Serpin在昆蟲的頭部、精巢和卵巢中的含量也很豐富，甚至在絲腺，中腸中也有分布，并且在受到外界微生物刺激時Serpin在昆蟲的血淋巴和脂肪體中大量表達（Tong Y and Kanost MR， 2005； Aratake H， et al.， 1990；

21、 Zou and Jiang， 2005）。有報道證明，一些Serpins在血細胞的細胞質(zhì)中表達，也有一些Serpins蛋白在細胞內(nèi)產(chǎn)生作用，定位于細胞質(zhì)或細胞質(zhì)和細胞核之中（Tong Y and Kanost MR， 2005； 樊凈， 2003） 。近10年來，昆蟲Serpin分子水平的研究進展很快，但與哺乳動物相比，其新基因的發(fā)現(xiàn)、基因結(jié)構(gòu)分析、表達調(diào)控和基因功能的研究較少，對于有些基因的功能機制還不清楚，在鱗翅目野桑蠶中的研究則

22、更少[6]。</p><p>　　目前對家蠶serpin家族成員的研究主要集中在Serpin6（劉襯麗，許雅香等）、Serpin16（董照明，趙萍等）和Serpin4（查宏賢，許雅香等）。其中對Serpin2的研究主要在煙草天蛾，Tong和Kanost（2002）發(fā)現(xiàn)煙草天蛾serpin2A參與免疫反應，抑制多種血淋巴蛋白酶，如煙草天蛾Serpin2抑制了血液中酚氧化酶原的活化級聯(lián)反應；使用革蘭氏陰性菌和陽性菌刺

23、激煙草天蛾后，Serpin2與血液中的HP1形成復合物；并且，Serpin2還同時與HP21以及另外兩個未鑒定的蛋白酶形成復合物。Zou等（2009）將家蠶34條serpin進行了進化分析，發(fā)現(xiàn)家蠶Serpin2與煙草天蛾的Serpin2A有較高同源性。 </p><p>　　為此本課題擬對家蠶Serpin2基因作較詳細有研究，主要集中在基因克隆，序列分析比對。為研究家蠶Serpin2蛋白的

24、功能打下基礎。本研究計劃利用基因Bank獲得了野桑蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serpin2）基因序列、通過已知序列設計引物。利用PCR技術(shù)基因克隆技術(shù)擴增并克隆家蠶Serpin2基因。經(jīng)基因測序，對序列進行分析和比對。從而達到研究目的。</p><p><b>　　1.材料和方法</b></p><p>　　1.1 材料及主要試劑</p><p>

25、　　家蠶（大造）cDNA、宿主菌E．coli TG1菌種、BL21菌皆為蘇州大學特種經(jīng)濟動物飼養(yǎng)實驗室保存。</p><p>　　克隆載體pUCm-T為Takara公司產(chǎn)品；原核表達載體pET-28a（+）由本實驗室保存。PCR試劑盒（內(nèi)含Taq酶、dNTPmix、10×buffer等）、凝膠回收試劑盒、250 bp DNA Marker、100bp-6000bp DNA Ladder Marker、限

26、制性內(nèi)切酶Hind3、BamH1和T4 DNA Ligase為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)Marker為Promega公司產(chǎn)品；小牛血清白蛋白為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量快速抽提試劑盒為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品。</p><p>　　NCBI的Blast工具；ExPASy在線ScanProsite程序（http://www.expasy. org/tools/pi_tool.html

27、）；http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP在線程序；DNAMAN軟件；Tanon Gis凝膠圖像處理系統(tǒng)。</p><p><b>　　1.2 方法</b></p><p>　　1.2.1 引物設計</p><p>　　根據(jù)家蠶Serpin-2序列設計一對引物擴增野桑蠶Serpin-2基因的ORF區(qū)域。&l

28、t;/p><p>　　正向引物SPN2F：5’-CCCAAGCTTTCAATTTCGTCCACG-3’</p><p>　　反向引物SPN2R：5’-CGCGGATCCATGGATTCAAAGGCT-3’</p><p>　　1.2.2 PCR擴增目的片段 </p><p>　　a. 在離心管中，按照Takara公司Taq酶的使用說明進行如下操作

29、： </p><p>　　b.將含上述混合物的反應管放入PCR儀中，PCR反應體系的條件如下： </p><p>　　c. PCR反應完成后，取5 μL電泳鑒定。</p><p>　　1.2.3 目的片段的分離和回收（Takara回收試劑盒）</p><p>　?。?）從電泳板上切割含目的DNA片段的凝膠塊。</p><p

30、>　　（2）將膠塊放入1.5 ml管中，將其適當切小，加速溶解。加入200 μl 膠塊融化液DR-I Buffer。</p><p>　　（3）均勻混合后75℃加熱融化膠塊。此時應間斷振蕩，使膠塊充分融化。</p><p>　　（4）向上述膠塊融化液中加入DR-II Buffer100 μl（1/2 DR-I Buffer量），均勻混合。（5）將試劑盒中的Spin Column安置

31、于Collection Tube上。</p><p>　?。?）將上述混合液轉(zhuǎn)移至Spin Column中， 12 000 r/min離心1 min，棄濾液。（5）將300 μl Rinse A加入Spin Column中，12 000 r/min離心30s，棄廢液。（6）將500 μl Rinse B加入Spin Column中， 12 000 r/min離心30s，棄廢液。（7）重復步驟（6）。（8）

32、將Spin Column安置于新的1.5ml的離心管上，在Spin Column膜中央處加入25ul</p><p>　　的滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置1min。</p><p>　　（9）12 000 r/min離心1 min洗脫DNA。</p><p>　　1.2.4 酶切反應 </p><p>　　在500 μL的

33、微離心管中依次加入ddH2O 8 μL，10×K buffer 2 μL ，質(zhì)粒8μL，限制性內(nèi)切酶各1 μL，組成20 μL酶切體系，37℃水浴反應2 h，取酶切產(chǎn)物8～10 μL進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測是否酶切完全，并拍照記錄。</p><p>　　1.2.5 連接反應</p><p>　　與pUCm-T載體連接（10μL）：在微離心管中依次加入PCR純化產(chǎn)物7.5

34、μL， 載體 pUCm-T 0.5 μL，T4 DNA Ligase buffer 1μL，T4 DNA Ligase 1μL；16℃水浴反應12 h。</p><p>　　1.2.6 感受態(tài)細胞制備 </p><p>　　用無菌鉑絲直接醮取E．coli TG1菌株，在LB平板表面劃線，37℃倒置培養(yǎng)過夜；從LB平板上挑取單菌落，接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜；取30

35、 μL培養(yǎng)液接種于3mL LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)2.5 h，至肉眼能看到微微渾濁；將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入1.5ml Eppendorf管，冰浴10 min；4℃、4 000 r/min×5 min，棄上清；用預冷的75mmol/L CaCl2 750μL輕輕懸浮細胞，冰浴30 min；4℃、4 000 r/min×4min，棄上清；加入預冷的75 mmol/L CaCl2 （內(nèi)含甘油終濃度為15％）200 μL，輕輕懸

36、浮，冰浴至少4 h，即成感受態(tài)細胞懸液，分裝后-70℃保存。</p><p>　　1.2.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 </p><p>　　取200 μL感受態(tài)細胞懸液，加入連接溶液10 μL，輕輕混勻，冰上放置30 min；42℃水浴1.5 min，冰上放置2.5 min，加入1 mL 37℃預熱的液體培養(yǎng)基，37℃預表達1 h，使細胞恢復正常生長狀態(tài)；4℃，3500 r/min×5

37、min，將菌液濃縮至200 μL，分別加入10 μL的IPTG和20μL X-gal，輕輕懸浮細胞，將菌液均勻涂布在含Amp+的LB固體培養(yǎng)基上，37℃正面放置30 min，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，37℃倒置培養(yǎng)過夜。</p><p>　　1.2.8 試劑盒抽提質(zhì)粒DNA</p><p>　　挑取轉(zhuǎn)化后的白色單菌落，分別接種于3 mL含適當Amp+抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃下200 r/

38、min振蕩培養(yǎng)過夜。 之后按照質(zhì)粒小量快速抽提試劑盒的說明書進行DNA抽提。1.2%瓊脂糖凝膠電泳至質(zhì)粒條帶遷移至凝膠中部以后，仔細分辨遷移率的差異，選取遷移率較小的幾管質(zhì)粒DNA用于進一步鑒定。</p><p>　　1.2.9 重組質(zhì)粒的鑒定及測序</p><p>　　取上述遷移率較小的幾管質(zhì)粒DNA用酶切進行鑒定；取適量的酶切或PCR產(chǎn)物進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。;</p&

39、gt;<p>　　取電泳結(jié)果符合預期的樣品送公司測序 </p><p>　　1.2.10 原核表達 </p><p>　　如圖1，構(gòu)建pET-28a(+)-Serpin-2原核表達質(zhì)粒。</p><p>　　挑取轉(zhuǎn)化有重組原核表達質(zhì)粒的大腸桿菌BL21單菌落，在含卡那霉素的3 mL LB液體培養(yǎng)基中37℃，200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取30 μL過夜培

40、養(yǎng)菌于含有卡那霉素的3 mL LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)；當OD600值約0.6時，加IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)6 h。取1.5 mL培養(yǎng)液于離心管中，10 000 g離心5 min，棄上清；加入100 μL TE buffer（pH 8.0），懸浮菌液沉淀，加入100 μL的2×樣品緩沖液，煮沸5 min，即可上樣。</p><p>　　圖1 Serpin

41、-2基因原核表達載體的構(gòu)建</p><p>　　1.2.11 SDS-PAGE蛋白電泳 </p><p>　　安裝好電泳槽，按表1配制4 mL 12%分離膠。迅速在兩玻璃板間灌注分離膠，加一層去離子水。將凝膠垂直靜置于室溫30 min。棄去分離膠上層去離子水，按表1制備2.5 mL 5%的濃縮膠，將配置好的濃縮膠快速灌注在兩玻璃板上部，并在上面插入梳子，小心操作避免混入氣泡；室溫聚合30

42、min，小心拔出梳子，在電泳槽中加入10×Tris甘氨酸電泳緩沖液，用注射器取10 µL BL21菌液、空載質(zhì)粒BL21菌液、表達樣品上樣，80V電泳；待溴酚藍從濃縮膠進入分離膠界面時，將電壓調(diào)至100V；待溴酚藍接近凝膠底部時，停止電泳；凝膠放入考馬斯亮藍染色液中染色10 min，棄染色液加脫色液脫色10min，棄脫色液后再次加脫色液在搖床上低速搖動1~2 h，直至背景清晰；最后拍照記錄。</p>&

43、lt;p>　　表1 SDS-PAGE電泳的凝膠配制（單位為mL） </p><p>　　注：APS需現(xiàn)配現(xiàn)用，0.1g過硫酸銨+1ml H2O。</p><p><b>　　2 實驗結(jié)果</b></p><p>　　2.1 家蠶Serpin-2基因的cDNA序列克隆</p><p>　　以野桑蠶cDNA為模板，利用

44、引物SPN2F和SPN2R進行PCR擴增反應，得到大約1100 bp的條帶(圖2)。將目的條帶連接T載體，利用原核克隆體系富集重組質(zhì)粒后進行酶切驗證。(圖3)</p><p>　　圖2 家蠶Serpin-2 編碼區(qū)克隆</p><p>　　M:250 bp分子量標準; 1: Serpin-2編碼區(qū)克隆</p><p>　　圖3 Serpin-2編碼區(qū)克隆重組質(zhì)粒酶切

45、鑒定</p><p>　　M: 6000 bpDNA Ladder Maker; 1: Hind3 、BamH1雙酶切的重組質(zhì)粒</p><p>　　2.2 野桑蠶Serpin-2基因的cDNA序列分析</p><p>　　通過軟件得到家蠶與野桑蠶Serpin-2基因序列相似性直觀分析圖（圖4）。圖中重合部分為相似部分，從圖中可知兩者相似度極高。 </p>

46、;<p>　　圖4 家蠶與野蠶的相似性分析</p><p>　　為了進一步研究二者的相似性，本研究通過blast方法在genbank網(wǎng)站中進行兩基因?qū)Ρ确治觯l(fā)現(xiàn)基因在相似部分堿基重合度為98.7%（圖5）</p><p>　　圖5野桑蠶和家蠶Serpin-2基因相似部分對比分析</p><p>　?。t色豎線表示堿基相同）</p>&l

47、t;p>　　又如圖6所示，測得的家蠶Serpin-2基因的ORF長度為987 bp，編碼329個氨基酸殘基。其蛋白質(zhì)預測分子量約為 43.75 kDa，等電點約為4.67。</p><p>　　10 20 30 40 50 60</p><p>　　1 ATGGATTCAAAGGCTTTATCCTC

48、TGCAGTCACCAAGTTCTCTGCAAAGTTTTGCAATGAA</p><p>　　1 M D S K A L S S A V T K F S A K F C N E </p><p>　　70 80 90 100 110 120</p><

49、;p>　　61 CTGGATAAAAAGAAGAATGTTGTATCATCGCCATTGTCAGCAGAATACTTGCTGGCGTTG</p><p>　　21 L D K K K N V V S S P L S A E Y L L A L </p><p>　　130 140 150

50、 160 170 180</p><p>　　121 ATAACTTTGGGAACTACTGATCCTGCACACGAAGAGCTATTGACAAGCCTAGGTATCCCG</p><p>　　41 I T L G T T D P A H E E L L T S L G I P </

51、p><p>　　190 200 210 220 230 240</p><p>　　181 GATGATGACACGATTCGCTCATCATTCTCGGCTGTGTCGTCAAAATTGAAATCAATAAAA</p><p>　　61 D D D T I R S S

52、 F S A V S S K L K S I K </p><p>　　250 260 270 280 290 300</p><p>　　241 GGTGTTACGTTTAATGTAGCCAACGAAATATACATCAAGGAGGGTGACTATGAGCTCGAC</p>&

53、lt;p>　　81 G V T F N V A N E I Y I K E G D Y E L D </p><p>　　310 320 330 340 350 360</p><p>　　301 CCAAAACTTAAGAAGGACGCTGTCGAGGTA

54、TTCGATGCAGATTTTGAAAAAGTTGACTTC</p><p>　　101 P K L K K D A V E V F D A D F E K V D F </p><p>　　370 380 390 400 410 420</p><p>

55、;　　361 GATAACGGAGCCGCAGCCGCCGGCCTAATAAACAAATGGGTTGAAAATAAAACAAATGAA</p><p>　　121 D N G A A A A G L I N K W V E N K T N E </p><p>　　430 440 450

56、460 470 480</p><p>　　421 CGTATTAAAGATCTCTTGAGTGAAGACAGCCTCGATTCGTATACGCGTTTGGTTTTGGTC</p><p>　　141 R I K D L L S E D S L D S Y T R L V L V </p>

57、<p>　　490 500 510 520 530 540</p><p>　　481 AACGCTCTCTACTTCAAGGGTACATGGCAAAACCAGTTCGACTCTATAAGCACCATGGAG</p><p>　　161 N A L Y F K G T W

58、Q N Q F D S I S T M E </p><p>　　550 560 570 580 590 600</p><p>　　541 CGACCGTTCTATGTTGACACCGAAACGACAGTTAATATTCCTATGATGTACCAAGAAAAT</p><p&

59、gt;　　181 R P F Y V D T E T T V N I P M M Y Q E N </p><p>　　610 620 630 640 650 660</p><p>　　601 AATTTCAAGTATGGTGAGAGCCACGACCTCAATGC

60、GCAGTTACTTGAAATGGCGTATGAA</p><p>　　201 N F K Y G E S H D L N A Q L L E M A Y E </p><p>　　670 680 690 700 710 720</p><p>　　66

61、1 GGTAACGATGCCAGCATGGTTATCGTGCTGCCGAACGAAATTAATGGCCTGGACGGGATA</p><p>　　221 G N D A S M V I V L P N E I N G L D G I </p><p>　　730 740 750 760

62、 770 780</p><p>　　721 CTGCAGAAGCTGGCCGATGGCTACGACCTAACTTCGGAACTGGACAAAATGTTCTCGACC</p><p>　　241 L Q K L A D G Y D L T S E L D K M F S T </p><

63、;p>　　790 800 810 820 830 840</p><p>　　781 AAAGTGCGAGTGACGGTGCCGAAATTCAAGATCGAAACTGAGATTGATCTACTTCAAGTT</p><p>　　261 K V R V T V P K F K I

64、 E T E I D L L Q V </p><p>　　850 860 870 880 890 900</p><p>　　841 TTGCCCAAGTTGGGTATTCAGGCGATCTTCAACCGCCAGAATTCCGGTCTGACCAAGATC</p><p>　　

65、281 L P K L G I Q A I F N R Q N S G L T K I </p><p>　　910 920 930 940 950 960</p><p>　　901 TTGGATAACGACGAGCCGCTGTACGTATCCAAGGCTGTGC

66、AAAAAGCCTTCATTGAAGTC</p><p>　　301 L D N D E P L Y V S K A V Q K A F I E V </p><p>　　970 980 990 1000 1010 1020</p><p>　　961

67、 AACGAGGAAGGCGCCGAAGCAGCCGCCTGA</p><p>　　321 N E E G A E A A A * </p><p>　　圖6家蠶Serpin-2基因的cDNA核苷酸序列及推導的氨基酸序列</p><p>　?。ㄐ翘枺ǎ┍硎窘K止密碼子）</p><p>　　2.3

68、Serpin-2重組表達載體酶切鑒定</p><p>　　將PCR產(chǎn)物回收純化后連接進pET-28a（+）原核表達載體；重組質(zhì)粒經(jīng)Hind3 、BamH1雙酶切鑒定，結(jié)果如圖（6）。在約1.2 kb大小位置出現(xiàn)了一條條帶，與預期結(jié)果相一致。</p><p>　　圖6 野桑蠶Serpin-2基因表達重組質(zhì)粒酶切鑒定</p><p>　　M. DNA marker；1.

69、帶有目的片段的pET-28a載體酶切結(jié)果</p><p>　　2.4 serpin-2的蛋白質(zhì)原核表達SDS-PAGE分析</p><p>　　家蠶Serpin-2重組轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導表達后，SDS-PAGE分析如圖7所示，在40～50 kDa大小位置誘導轉(zhuǎn)化目的基因Serpin-2的BL21菌與對照組BL21(DE3)菌、空pET-28a(+)轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌相比出現(xiàn)了一條特

70、異性的蛋白質(zhì)條帶(圖7中箭頭所指)，而預測的野桑蠶Serpin-2蛋白分子量約為43.75 kDa,與預期的所要表達的Serpin-2蛋白分子量大小相符，推測家蠶Serpin-2基因在大腸桿菌中得到成功表達。</p><p>　　圖7 Serpin-2基因表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳和Western Blot分析</p><p>　　M．蛋白質(zhì)Marker；1．無質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21菌的

71、表達; 2. 空載體pET-28a轉(zhuǎn)化BL21菌后的表達；3.經(jīng)1mM IPTG誘導的pET-28a-Serpin-2的表達；</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　家蠶( Bombyx mori L. )和 野桑蠶( Bombyx mandarina Moore) 同屬鱗翅目家蠶蛾科。研究證明,家蠶與野桑蠶的血緣十分親近[7]，根據(jù)野桑蠶

72、Serpin-2序列設計引物，采用PCR方法成功克隆了家蠶Serpin-2基因。序列分析表明，家蠶Serpin-2基因編碼區(qū)長度為987 bp，編碼329個氨基酸，相對分子量約為43.75 kDa，等電點約為4.67。與家蠶Serpin-2比較發(fā)現(xiàn)，兩者基因序列相似度達99.29%，有8個基因不同；氨基酸序列相似度達98.93%，4個氨基酸殘基有差異。推測野桑蠶與家蠶Serpin-2起著相同或類似的作用。</p><

73、p>　　將野桑蠶Serpin-2基因克隆進原核表達載體pET-28a(+)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導表達后，SDS-PAGE電泳表明，野桑蠶Serpin-2在大腸桿菌中成功表達，蛋白相對分子量約44kDa，與推導的蛋白分子量相符。pET-28a（+）作為原核表達載體，它含有T7啟動子，是一種T7噬菌體表達系統(tǒng)，具有能轉(zhuǎn)錄大腸桿菌RNA聚合酶不能有效轉(zhuǎn)錄基因的優(yōu)點，而且其轉(zhuǎn)錄效率比大腸桿菌RNA聚合酶高5倍

74、，能夠高效轉(zhuǎn)錄mRNA，大量表達目的蛋白。其多克隆位點上游有6個組氨酸和凝血酶位點，可利用固化Ni2+親和層析柱純化表達的融合蛋白，還可以用凝血酶切割純化的融合蛋白，從而獲得重組的目的蛋白，是一種較好的表達載體。與真核表達系統(tǒng)相比，具有成本低廉，操作簡單，容易培養(yǎng)，生產(chǎn)周期短，易于獲得高水平表達蛋白的優(yōu)點[8]。本研究成功構(gòu)建了含有Serpin-2基因完整ORF序列的原核表達載體，并且目的基因在原核大腸桿菌細胞中成功表達，為進一步對該表

75、達產(chǎn)物的活性分析及相關功能研究提供了參考。</p><p>　　目前，昆蟲Serpin-2的功能特性尚無清晰的研究和認證，鑒于Serpin超家族成員的同源性較高，可以從研究該家族中其他成員著手，探索研究Serpin-2的生理功能。很多實驗表明Serpin 在昆蟲中具有一定的免疫作用。它們與絲氨酸類蛋白酶形成非共價復合物，在局部發(fā)生黑化反應，阻止絲氨酸蛋白酶的級聯(lián)反應，從而抑制多酚氧化酶原的激活，發(fā)揮它們的免疫功能

76、[9]。</p><p>　　經(jīng)分析，該野桑蠶Serpin-2基因編碼的氨基酸序列中不含信號肽序列。信號肽在蛋白分泌的過程中起重要作用,分泌性蛋白質(zhì)合成后由信號肽引導其穿過合成所在的細胞到其他組織細胞中[10]。該研究中Serpin-2基因編碼的氨基酸序列中不含信號肽序列表明它在細胞內(nèi)起作用，這一點跟煙草天蛾Serpin-2有共同之處。煙草天蛾Serpin-2是一種細胞內(nèi)蛋白質(zhì)[11]，在細菌刺激后，該基因在血細

77、胞的細胞質(zhì)中表達[12]。野桑蠶Serpin-2在細胞內(nèi)的調(diào)控網(wǎng)絡中如何發(fā)揮作用，其具體調(diào)節(jié)機制和功能還有待更進一步研究。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 于繼彬,季平,沈衛(wèi)德.野桑蠶的遺傳多樣性及其研究進展(J).中國農(nóng)業(yè), 2001, 22(4):51-5</p><p>　　[2] 張梅,朱柞銘,

78、1996.絲氨酸蛋白酶抑制劑的研究及應用.生物化學與生物物理進展,23(3): 240-244</p><p>　　[3] 樊靜.絲氨酸蛋白酶抑制劑B家族(J).生命的化學,2003,23(4):275-276</p><p>　　[4] Carrell RW, Bowell DR, 1986. Serpins: the superfamily of plasma serine prote

79、inase inhibitors. Elsevier Biomedical Press, 403–419.</p><p>　　[5] 吳秀萍,于申業(yè),劉相葉等.旋毛蟲Serpin 基因的體外表達及其特性鑒定(J).中國生物制品學雜志,2009,02,22(2)</p><p>　　[6] 劉襯麗,王東,李兵等. 家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑基因serpin-6的克隆、序列分析和組織表達(J).

80、昆蟲學報.2009.01</p><p>　　[7] 中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所.中國養(yǎng)蠶學(M).上海:上?？萍汲霭嫔?1991</p><p>　　[8] 董偉,董曉慧,楚雍烈等.人殺菌滲透增強性蛋白N末端片段在大腸桿菌中的表達.西安交通大學學報,2006,27(1): 11-14.</p><p>　　[9] Zhu Y, Wang Y, Gorman MJ,

81、et al., 2003. Manduca sexta Serpin-3 regulates prophenoloxidase activation in response to infection by inhibiting prophenoloxidase- activating proteinases. J. Biol. Chem., 278(47): 46556-46564.</p><p>　　[10]

82、 鄭斌,詹希美.信號肽序列及其在蛋白質(zhì)表達中的應用(J).生物技術(shù)通訊.2005年3期</p><p>　　[11] Gan H, Wang Y, Jiang HB, et al., 2001. A bacteria induced, intracellular serpin in granular hemocytes of Manduca sexta. Insect Biochem.Mol.Biol., 31(

83、9): 887-898.</p><p>　　[12] Tong Y, Kanost MR, 2005. Manduca sexta serpin-4 and serpin-5 inhibit the prophenol oxidase activation pathway. J. Biol. Chem., 280(15): 14 923-14 931.</p><p><b>

84、　　致 謝</b></p><p>　　本次畢業(yè)設計是在許XX副教授的悉心指導下完成的。實驗過程中我不斷地遇到各種困難，在想放棄的時候是許老師一直鼓勵我做下去，直到實驗成功。許老師一絲不茍的工作作風、嚴謹?shù)闹螌W態(tài)度、真誠待人的品德風范，使我受益匪淺。在這一年中，許老師不僅在學業(yè)上給予我精心指導，在生活上也給予我關懷和愛護，在我遇到生活中無法解決的矛盾問題時，許老師能夠耐心聽我的傾訴并教授我相關的人

85、生經(jīng)驗，給與我最大的鼓勵和支持。在此，向許雅香老師表示衷心的感謝，感謝許老師在過去一年中為我的成長傾注了心血。</p><p>　　感謝沈衛(wèi)德老師的關心與鼓勵。沈老師的平易近人和諄諄教誨將使我終身受益。</p><p>　　感謝班主任王艷紅老師及所有教授過我課程的蘇州大學的老師們，是你們的誨人不倦才有了現(xiàn)在的我。</p><p>　　特別感謝査宏賢師兄、孫姍姍師姐在

86、實驗設計上給予的有益啟示和實驗操作中給予的指導和幫助，感謝特種經(jīng)濟動物飼養(yǎng)實驗室老師同學給予我的各方面的支持和幫助。</p><p>　　感謝父母不求回報地付出。</p><p>　　最后，謹向論文評閱和答辯的全體專家致以最真誠的謝意。</p><p><b>　　附錄1.</b></p><p>　　pUCm-T載體(

87、pUCm-T Vector)是用于克隆含有A末端PCR產(chǎn)物的理想載體?？梢酝ㄟ^藍白斑篩選有插入片斷的重組克隆。</p><p>　　很多DNA聚合酶在進行PCR擴增時會在PCR產(chǎn)物雙鏈DNA每條鏈的3’端加上一個突出的堿基A。pUCm-T載體是一種已經(jīng)線性化的載體，載體每條鏈的3’端帶有一個突出的T。這樣，pUCm-T載體的兩端就可以和PCR產(chǎn)物的兩端進行正確的AT配對，在連接酶的催化下，就可以把PCR產(chǎn)物連接到