紫外線誘變改善酵母菌表面性質(zhì)研究【開題報告+文獻(xiàn)綜述+畢業(yè)論文】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報告</b></p><p><b>　　環(huán)境工程</b></p><p>　　紫外線誘變改善酵母菌細(xì)胞表面性質(zhì)研究</p><p>　　一、選題的背景與意義</p><

2、p>　　紫外線是常用的物理誘變因子, 是誘發(fā)微生物突變的一種非常有用的工具。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很強(qiáng)的紫外光吸收能力,最大的吸收峰在260nm。紫外輻射能作用于DNA ,因此在260nm的紫外輻射是最有效的致死劑。對于紫外的作用已有多種解釋,但研究的比較清楚的一個作用是使DNA分子形成嘧啶二聚體,即兩個相鄰的嘧啶共價連接[。二聚體出現(xiàn)會減弱雙鍵間氫鍵的作用,并引起雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形,阻礙堿基間的正常配對,從而有可能引起突變或

3、死亡。二聚體的形成，會妨礙雙鏈的解開,因而影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。紫外輻射可以引起轉(zhuǎn)換、顛換、移碼突變或缺失等。 </p><p>　　日本于20世紀(jì)70年代就有人進(jìn)行了利用酵母茵處理廢水的探索性研究。并于90年代成功地實(shí)現(xiàn)了酵母茵廢水處理技術(shù)的工程應(yīng)用。日本一制油廠利用酵母處理高含油廢水，對于平均含油量達(dá)11900mg/L的廢水，除油率可達(dá)99%。此外，通過在反應(yīng)器中接入功能菌株能增加目標(biāo)底物的降解，降低其毒性

4、。同時也可以縮短降解時間，酵母已被成功應(yīng)用于處理高濃度含油廢水以及石油的脫蠟等。然而，在酵母菌處理廢水的實(shí)際運(yùn)行中，酵母菌對廢水的處理效果往往受到其表面性質(zhì)的影響而不夠理想。因此，可利用紫外誘變得到疏水性好、乳化能力強(qiáng)、絮凝性好的酵母菌菌株，并進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)得到遺傳性狀穩(wěn)定的菌株。從而使酵母菌對廢水中COD的去除率提高。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p&

5、gt;<b>　　基本內(nèi)容：</b></p><p>　　1． 綜述紫外誘變育種（微生物）的方法和技術(shù)路線；</p><p>　　2． 設(shè)計實(shí)驗(yàn)，誘變酵母菌細(xì)胞；</p><p>　　3． 考察誘變后酵母細(xì)胞表面性質(zhì)的變化；細(xì)胞表面性質(zhì)：疏水性、絮凝性、乳化能力等；</p><p>　　4． 篩選對于廢水處理有益的誘變菌

6、株，主要是COD降解能力高、絮凝性好等特點(diǎn)。</p><p><b>　　擬解決的主要問題:</b></p><p>　　通過紫外線照射酵母菌對其進(jìn)行誘變，再以相應(yīng)的分析方法分析誘變所得菌株的疏水性、絮凝性以及乳化能力，篩選出COD降解能力強(qiáng)、絮凝性好的對廢水處理有益的酵母菌菌株。</p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p&g

7、t;<p><b>　　技術(shù)路線：</b></p><p>　　①構(gòu)建紫外誘變酵母菌實(shí)驗(yàn)臺，對培養(yǎng)所得的酵母菌進(jìn)行紫外誘變。</p><p>　?、诮φT變所得的酵母菌菌株進(jìn)行表面性質(zhì)的定性定量分析方法，主要分析酵母菌的疏水性、</p><p><b>　　絮凝性和乳化能力。</b></p>

8、<p>　?、鄹鶕?jù)上述定性定量所得結(jié)果，篩選出有益于廢水處理的酵母菌菌株。 </p><p><b>　　2、實(shí)驗(yàn)部分：</b></p><p><b>　　2.1主要儀器</b></p><p>　　紫外線照射燈，恒溫振蕩器，超凈工作臺。</p>

9、<p><b>　　2.2收集菌種</b></p><p>　　配制YPD液體培養(yǎng)基，用無菌接種環(huán)將熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)菌株接入YPD培養(yǎng)基中，將接種后的YPD培養(yǎng)基封口，移至恒溫振蕩器中于溫度28℃，175rpm連續(xù)培養(yǎng)48小時后取出，然后收集菌體。</p><p><b>　　2.3實(shí)驗(yàn)步驟</b>&

10、lt;/p><p>　　先將紫外線照射燈打開預(yù)照射20min，再將培養(yǎng)所得的酵母菌放到超凈工作臺中紫外線下30cm處照射，照射時間在20-40s之間。再對誘變菌株進(jìn)行表面性質(zhì)定性定量分析，最后篩選出表面性質(zhì)優(yōu)良的菌株進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。</p><p><b>　　3、結(jié)果分析</b></p><p>　　根據(jù)相關(guān)的定性定量方法，分析并篩選出疏水性好、絮

11、凝性好、乳化能力強(qiáng)的酵母菌菌株，此類酵母菌有益于廢水中有機(jī)物的降解去除</p><p>　　四、研究的總體安排與進(jìn)度：</p><p>　　2010.11.01－2009.11.10 選題；</p><p>　　2010.11.26－2010.12.15 收集整理資料，完成開題報告、文獻(xiàn)綜述；開題；</p><p>　　2010.12

12、.16－2011.04.10 翻譯相關(guān)英文資料，依據(jù)大綱開展實(shí)驗(yàn)工作；</p><p>　　2011.04.11－2011.04. 20 完成論文初稿交由老師審閱；</p><p>　　2011.04.21－2011.05.06 完成論文二稿交由老師審閱；</p><p>　　2011.05.07－2010.05.12 定稿，準(zhǔn)備答辯相關(guān)材料；<

13、/p><p>　　2011.05.13 答辯。</p><p><b>　　五、主要參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1]　Madigan ,M. T(美) Martinko J.M(美),Parker,J.(美).微生物生物學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社, 2001 :390.</p><p>　　[2]　曹友聲, 劉

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25、><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　環(huán)境工程</b></p><p>　　紫外線誘變改善酵母菌細(xì)胞表面性質(zhì)研究</p><p>　　摘要：本文主要介紹了紫外誘變在微生物育種中的誘變原理以及對酵母菌進(jìn)行紫外誘變的重要意義。簡單介紹了紫外誘變在微生物育種的方法和應(yīng)用，酵母菌細(xì)胞的表面性質(zhì)及

26、其測定方法，以及菌株的篩選方法。</p><p>　　關(guān)鍵詞：紫外誘變；假絲酵母菌；表面性質(zhì)；菌株篩選</p><p>　　通過圖書館查閱大量相關(guān)書籍資料和網(wǎng)上收集相關(guān)課題的論文資料，現(xiàn)文獻(xiàn)綜述內(nèi)容如下。</p><p>　　一、紫外誘變在微生物育種中的原理和紫外誘變酵母菌的意義</p><p>　　紫外線是常用的物理誘變因子, 是誘發(fā)微生物

27、突變的一種非常有用的工具。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很強(qiáng)的紫外光吸收能力,最大的吸收峰在260nm。紫外輻射能作用于DNA ,因此在260nm的紫外輻射是最有效的致死劑。對于紫外的作用已有多種解釋,但研究的比較清楚的一個作用是使DNA分子形成嘧啶二聚體,即兩個相鄰的嘧啶共價連接[1]。二聚體出現(xiàn)會減弱雙鍵間氫鍵的作用,并引起雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形,阻礙堿基間的正常配對,從而有可能引起突變或死亡。二聚體的形成，會妨礙雙鏈的解開,因而影響DNA

28、的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。紫外輻射可以引起轉(zhuǎn)換、顛換、移碼突變或缺失等[2]。 </p><p>　　日本于20世紀(jì)70年代就有人進(jìn)行了利用酵母茵處理廢水的探索性研究。并于90年代成功地實(shí)現(xiàn)了酵母茵廢水處理技術(shù)的工程應(yīng)用。日本一制油廠利用酵母處理高含油廢水，對于平均含油量達(dá)11900mg/L的廢水，除油率可達(dá)99%[3]。此外，通過在反應(yīng)器中接入功能菌株能增加目標(biāo)底物的降解，降低其毒性[4-5]。同時也可以縮短降解時間，酵母

29、已被成功應(yīng)用于處理高濃度含油廢水以及石油的脫蠟等[6-8]。然而，在酵母菌處理廢水的實(shí)際運(yùn)行中，酵母菌對廢水的處理效果往往受到其表面性質(zhì)的影響而不夠理想。因此，可利用紫外誘變得到疏水性好、乳化能力強(qiáng)、絮凝性好的酵母菌菌株，并進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)得到遺傳性狀穩(wěn)定的菌株。從而使酵母菌對廢水中COD的去除率提高。</p><p>　　二、紫外誘變在微生物育種的方法及其應(yīng)用</p><p>　　紫外線照射

30、應(yīng)在暗室內(nèi)進(jìn)行，且應(yīng)在紅光下操作。采用15～20瓦、波長為260nm左右的紫外線燈，燈管懸掛高度約30cm。處理方法：取斜面菌種一環(huán)，移接到已滅菌的盛有生理鹽水40ml的三角瓶內(nèi)，置搖床上振蕩30min。然后將其中5ml菌懸液倒入已滅菌的直徑為9cm的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿底要平、照射時啟動旋轉(zhuǎn)器或電磁攪拌器，紫外線燈照射時間為20～40s。</p><p>　　齊秀蘭等[9]以妥布霉素產(chǎn)生菌黑暗鏈霉菌ATCC1792

31、0為出發(fā)菌株,經(jīng)紫外線處理,獲得一株產(chǎn)量較高且穩(wěn)定的菌株UV259,其效價比原株提高92.3%。周建琴等[10]用康樂霉素(K2C)產(chǎn)生菌的自然突變株ST291為出發(fā)菌株,采用UV誘變和自然分離純化的方法,篩選出1株突變株U102S24。發(fā)酵條件優(yōu)化后,5噸罐上K2C效價比ST291提高460多倍。王筱虹等[11]用UV照射紅霉素產(chǎn)生菌紅色鏈霉菌的原生質(zhì)體,得到比對照菌株效價提高225.8%的高產(chǎn)菌株。值得注意的是,白蘭芳等[12]以紫

32、外線、光復(fù)活處理西羅莫司產(chǎn)生菌,得到正變株UV28261的效價較出發(fā)菌株高2～3倍,且紫外照射后,光復(fù)活處理比暗修復(fù)處理的正變率高得多,這與UV處理菌種后必須暗修復(fù)的傳統(tǒng)觀點(diǎn)恰恰相反。</p><p>　　三、酵母菌表面性質(zhì)的表面性質(zhì)</p><p><b>　　3.1 疏水性</b></p><p>　　有研究報道指出，菌株的疏水性對于其在生

33、物處理體系中的活性及穩(wěn)定性均有重要影響[13]。在利用真菌與細(xì)菌復(fù)合反應(yīng)器進(jìn)行生物除臭的過程中發(fā)現(xiàn)，親水性的污染物基本上能夠在細(xì)菌區(qū)內(nèi)被去除。而疏水性的污染物則較易在真菌區(qū)內(nèi)被去除。微生物細(xì)胞表面的疏水性。提高了其與疏水性有機(jī)物之間的親和力，有利于微生物吸收轉(zhuǎn)化污染物。一種能利用疏水性烴類物質(zhì)的酵母茵Catldida tropicalis。其細(xì)胞表面組成成分可能與這類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。Zhang和Miller研究了幾株P(guān)aeruginos

34、a細(xì)胞表面疏水性與疏水性烴類降解率之間的關(guān)系。結(jié)果表明，細(xì)胞表面的疏水性越高。其對這類物質(zhì)的降解速率越快。因此細(xì)胞表面的疏水性與疏水性污染物的降解速率密切相關(guān)[14]。</p><p><b>　　疏水性分析方法：</b></p><p>　　菌株YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的48h菌株，每個菌株的菌液取45mL于離心管中，放入TGL-16M高速臺式冷凍機(jī)中，離心機(jī)的參

35、數(shù)設(shè)置為3000rpm，離心三分鐘后倒去上清液，加入醋酸-醋酸鈉緩沖液至40mL再次離心（需要兩次加入緩沖離心），將離心得到的細(xì)胞培養(yǎng)物懸浮于絮凝緩沖液中，調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)物的濃度使得OD620=2，接著取出4mL懸液于10ml的帶帽小試管中，加入1mLn-十六烷或1mL色拉油，漩渦振蕩60s（30s后間歇5s，再繼續(xù)下一個30s），兩相分離5 min后，用移液槍取出下層的水相于比色皿中在722型可見分光光度計上讀出OD620。 </

36、p><p><b>　　3.2 乳化能力</b></p><p>　　有研究指出，一些以疏水性烴類物質(zhì)作為碳源的酵母具有產(chǎn)生乳化劑的能力：酵母茵Yarrowia/ipolytica(NCIM 3589)在以烷烴作為碳源時具有產(chǎn)生乳化劑的能力(zinjarde and Pant，2002）。Cameron等的研究表明，啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae

37、細(xì)胞壁的主要成分甘露蛋白是高效的生物乳化劑，其pH穩(wěn)定范圍可以在2～11。除此以外，Candida tropicalis、Candida antarctica等酵母茵也具有產(chǎn)生生物乳化劑的能力。酵母菌株的乳化能力對于其在生物強(qiáng)化體系中的穩(wěn)定性可能起到重要的作用。具有較強(qiáng)的乳化能力的酵母菌在廢水處理中能夠快速地使廢水中的有機(jī)污染物乳化而進(jìn)一步被降解。從而使得廢水處理效果得到改善[15]。</p><p><b

38、>　　乳化能力分析：</b></p><p>　　各菌株的富集培養(yǎng)：用YPD液體培養(yǎng)基在合適的條件下富集培養(yǎng)9個菌株。</p><p>　　無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基：取800mL去離子水，按以下比例投加無機(jī)鹽：0.4%NH4NO3，0.47%KH2PO4，0.03%Na2HPO4·12H2O，0.1%MgSO4·H2O，0.001%FeSO4·7H2

39、O，0.001%CaCl2·2H2O，0.001%MnSO4·4H2O；加入2%商品色拉油，定容到1000mL后，調(diào)節(jié)pH為5.0。最后在10個250mL的三角瓶中各裝100mL上述含油無機(jī)鹽培養(yǎng)基，在121℃滅菌20min。取出冷至室溫后，取各菌株的菌液1mL分別接入10個不同的三角瓶中，隨后在175rpm，28℃空氣浴振蕩搖床中培養(yǎng)2-3d。觀察各菌株對于色拉油的乳化情況。 </p><p&g

40、t;<b>　　3.3 絮凝性</b></p><p>　　酵母絮凝定義為酵母的一種能粘附成團(tuán)之后從培養(yǎng)基中沉淀出去,并能被乙二胺四乙酸或?qū)Ｒ惶撬稚⒌奶匦?。酵母絮凝性能的好壞直接影響到酵母回收利用、發(fā)酵速率和發(fā)酵度、過濾方法的選擇、啤酒的風(fēng)味、質(zhì)量、成本等諸多方面[16-19] ,是評價菌種優(yōu)劣的一個重要指標(biāo)。</p><p>　　酵母菌良好的絮凝性有利于酵母菌吸附

41、廢水中的污染物，并對其進(jìn)行生化降解。其良好的絮凝性對于廢水處理能起到很好的作用效果。</p><p><b>　　絮凝性的測定方法</b></p><p><b>　　本斯法[20]</b></p><p>　　取5g酵母泥,加入30mL0.051%CaSO4溶液洗滌、離心,重復(fù)操作2次。稱取110g洗凈酵母泥于15mL帶

42、刻度的錐底離心管中, 加入10mLpH4150 CaSO4 、醋酸鈉2醋酸的緩沖液,振蕩均勻于20℃保溫20min后,再次振蕩均勻10min后,記錄離心管底部沉淀酵母的體積(mL),定義該數(shù)值為本斯值。數(shù)值越大則該酵母愈易絮凝。</p><p><b>　　光密度法[20]</b></p><p>　　稱取酵母泥110g ,加入0.01mol/ L 的EDTA2Na溶

43、液洗滌、離心2次。將沉淀物放入50mL具塞的比色管中,加入50mL pH4150 CaSO4、醋酸鈉2醋酸的緩沖液振蕩搖勻,立即在波長670nm下測定其吸光度,記為OD1；20℃恒溫水浴靜置30min后,取距液面1cm處溶液,測定對應(yīng)的吸光度,記為OD2。定義凝聚值F =[ (OD1 - OD2)/ OD1]×100%。數(shù)值越大對應(yīng)的酵母則愈易絮凝。</p><p><b>　　四、菌株篩選&

44、lt;/b></p><p>　　除了誘變過程的最適條件外,突變菌株的分離和篩選也是微生物育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。篩選一般分初篩和復(fù)篩兩個階段。初篩可在搖瓶中完成,也可采用瓊脂塊法, 即將適宜的反應(yīng)試劑噴涂在平板上正在生長的菌落中, 或采用混合指示劑在培養(yǎng)基上染色, 直接觀察特定的酶活性, 或者將待測菌落打塊, 放置在涂有特定菌的檢定盤上,依抑菌圈的大小定量測定菌株的抗菌活性物質(zhì)的含量。初篩得到的高產(chǎn)菌株, 再進(jìn)行

45、搖瓶復(fù)篩,對其生產(chǎn)性能作更精確的定量測定[21]。經(jīng)紫外誘變后所得到的疏水性好，絮凝性好，乳化能力強(qiáng)的酵母菌菌株在利用相應(yīng)分析方法篩選出來后，即可進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，以得到更多的性狀良好的菌株。</p><p><b>　　五、展望</b></p><p>　　紫外誘變作為最簡單便捷的物理誘變育種方法在微生物育種領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。與此同時，酵母菌污水處理系統(tǒng)比馴化后的活性

46、污泥法工藝無論是反應(yīng)速率還是污染物去除效率都具有很大的優(yōu)勢,所以酵母菌污水處理技術(shù)是值得推廣的；隨著酵母菌利用的范圍不斷擴(kuò)大,酵母菌使用的方式和手段越來越多。因此，使用簡單的紫外誘變方法來獲得表面性狀良好的酵母菌菌株應(yīng)用到廢水處理工藝中具有重要意義。這對于廢水中的COD去除率的提高將起到很大作用。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[

47、1]　Madigan ,M. T(美) Martinko J.M(美),Parker,J.(美).微生物生物學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社, 2001 :390.</p><p>　　[2]　曹友聲, 劉仲敏.現(xiàn)代工業(yè)微生物學(xué)[M].長沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版社,1998.</p><p>　　[3] ChigusaK，et al Treatment ofwastewatorfrom oilma

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55、tation and Bioengineering，1995，80(3)：270-275.</p><p>　　[14] Zhang Y Miller R．Effect of a Pseudomonasrhamnolipid biosurfactant on cell hydrophobicily and biodegradation of octadecane [J]．Appl Environ Microbi

56、ol 1994，60，2l01-2106.</p><p>　　[15] 楊敏，鄧艷芹，張昱等，酵母菌在疏水性有機(jī)污染物去除方面的應(yīng)用[J].生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)，2008,4:28-31.</p><p>　　[16] You-Im Chang , Lian2Hua Shih , Shyh2Wei Chen. Effects of glucose and mannose on the flo

57、cculation behavior of Saccharomyces cerevisiae at different life stages [J].</p><p>　　Colloids and Surfaces B:Biointerfaces ,2005,44:6-14.</p><p>　　[17] 張博潤,任健,劉玉方.酵母菌絮凝機(jī)理研究進(jìn)展及應(yīng)用前景[J].微生物學(xué)通報,19

58、96, 23（5):307-311.</p><p>　　[18] 王筱虹, 等.原生質(zhì)體紫外誘變技術(shù)篩選紅霉素高產(chǎn)菌株的研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報, 2000,31(4):301-303.</p><p>　　[19] 唐曉達(dá)，張秀麗，蔡車國，等．低雙乙酰啤酒酵母菌種選育及其中試[J]．廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2003，42(4)：5O8-510．</p><

59、;p>　　[20] 管教儀. 啤酒工業(yè)手冊[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1999.355-356.</p><p>　　[21] 王付轉(zhuǎn),梁秋霞,李宗偉,王雁萍,吳健.誘變和篩選方法在微生物育種中的應(yīng)用[J].洛陽師范學(xué)院學(xué)報2002，2：95-96.</p><p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b&g

60、t;　　環(huán)境工程</b></p><p>　　紫外線誘變改善酵母菌表面性質(zhì)研究</p><p>　　Effects of Ultraviolet mutagenesis on cell Surface characteristics of yeast</p><p><b>　　摘　要</b></p><p>

61、;　　摘要：酵母菌細(xì)胞表面性質(zhì)影響酵母菌在廢水處理系統(tǒng)中的效果，本研究通過對O2、G1兩株酵母菌在30W的紫外燈下進(jìn)行不同時間的照射誘變，研究紫外誘變對于酵母菌細(xì)胞表面性質(zhì)的影響。研究結(jié)果表明，O2、G1菌株的表面性質(zhì)得到不同程度的改善。O2菌株在紫外線照射10s的條件下，疏水性改善最大，提高了19.10%，O2菌株在紫外線照射20s的條件下，乳化能力改善最大，提高了53.85%；G1菌株在紫外線照射20s的條件下，疏水性和乳化能力均得

62、到了最大改善，分別提高了18.40%和43.75%。而紫外線誘變對O2、G1菌株的絮凝性影響不明顯。</p><p>　　關(guān)鍵詞：酵母菌；疏水性；絮凝性；乳化能力；紫外誘變</p><p>　　Effects of Ultraviolet mutagenesis on cell </p><p>　　Surface characteristics of yeast&

63、lt;/p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　Abstract：Cell surface characteristics of yeast affect the effect of yeast in the wastewater treatment system.Two strains（O2 and G1）were teeated by U

64、V radiation under the 30W UV lamp for different time，the effects of Ultraviolet mutagenesis on cell surface characteristics of yeast were investigated.The results showed that，the cell surface characteristics of O2 and G1

65、 strains can be improved to varying degrees.When strain O2 was exposed under UV radiation for 10s,the hydrophobicity was of the most</p><p>　　Keywords：yeasts; hydrophobicity; flocculability; emulsifying capa

66、city; UV radiation </p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　1 引言5</b></p><p>　　1.1 紫外線誘變技術(shù)概況5</p><p>　　1.1.1 紫外線簡介5</p><p>　　1.1.2 紫外線

67、誘變機(jī)理5</p><p>　　1.1.3 紫外線誘變技術(shù)的應(yīng)用情況5</p><p>　　1.2 酵母菌在廢水處理中的應(yīng)用6</p><p>　　1.2.1 酵母菌6</p><p>　　1.2.2 工業(yè)用酵母菌的分類6</p><p>　　1.2.3 酵母菌菌株的篩選6</p>&

68、lt;p>　　1.2.4 酵母菌在廢水處理中的應(yīng)用7</p><p>　　1.3 研究的目的與意義8</p><p><b>　　2材料與方法9</b></p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑9</p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器9</p><p>　　2.1.

69、2 主要試劑9</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法10</p><p>　　2.2.1 酵母菌的培養(yǎng)及篩選10</p><p>　　2.2.2 酵母菌的疏水性測定10</p><p>　　2.2.3 酵母菌的絮凝性測定11</p><p>　　2.2.4 酵母菌的乳化能力測定11</p&

70、gt;<p>　　2.2.5 紫外線處理酵母菌細(xì)胞11</p><p>　　2.2.6 誘變后酵母菌相關(guān)表面性質(zhì)的測定12</p><p>　　3結(jié)果與分析12</p><p>　　3.1 誘變前酵母菌表面性質(zhì)分析12</p><p>　　3.1.1 誘變前酵母菌的疏水性12</p><p

71、>　　3.1.2 誘變前酵母菌的絮凝性13</p><p>　　3.1.3 誘變前酵母菌的乳化能力13</p><p>　　3.2 誘變后酵母菌表面性質(zhì)分析14</p><p>　　3.2.1 誘變后酵母菌的疏水性14</p><p>　　3.2.2 誘變后酵母菌的絮凝性15</p><p>

72、　　3.2.3 誘變后酵母菌的乳化能力15</p><p>　　3.3 紫外誘變前后各性質(zhì)變化的對比15</p><p>　　3.3.1 疏水性15</p><p>　　3.3.2 絮凝性16</p><p>　　3.3.3 乳化能力17</p><p><b>　　4結(jié)論18<

73、/b></p><p><b>　　5展望19</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)20</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　引言</b></p><p>　　1.1 紫外線誘變技術(shù)概況

74、</p><p>　　1.1.1 紫外線簡介</p><p>　　紫外線是波長短于紫色可見光而又緊接紫色光的射線，波長范圍為136～390 nm，即1360～3900Å。它是一種非電離輻射，紫外線波長雖然比較寬，但是誘變有效范圍僅是200～300 nm，其中以260 nm效果最好。所以能引起殺菌或誘變，主要是紫外線的作用光譜與核酸的吸收光譜一致，所以DNA很容易受到紫外線的影響

75、。</p><p>　　1.1.2 紫外線誘變機(jī)理</p><p>　　紫外線被DNA吸收后引起突變的原因，有的是DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)，有的是胞嘧啶與尿嘧啶之間的水合作用，有的是DNA鏈的斷裂，還有的是形成嘧啶二聚體。而形成嘧啶二聚體是產(chǎn)生突變的主要原因。使DNA分子產(chǎn)生嘧啶二聚體，即兩個相鄰的嘧啶共價連接[1]，是目前研究的較清楚的一個紫外線的作用。二聚體出現(xiàn)會減弱雙鍵間氫鍵的作用,并

76、引起雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形,阻礙堿基間的正常配對,從而有可能引起突變或死亡。二聚體的形成，會妨礙雙鏈的解開,因而影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。紫外輻射可以引起轉(zhuǎn)換、顛換、移碼突變或缺失等[2]。</p><p>　　微生物在正常生長情況下進(jìn)行DNA復(fù)制時，首先DNA雙鏈解開成為單鏈，然后兩條單鏈各自與細(xì)胞內(nèi)游離的堿基互補(bǔ)配對形成新鏈。如果此時雙鏈之間有嘧啶二聚體存在，則因在一條鏈上出現(xiàn)嘧啶二聚體，則會影響到此處復(fù)制過程中堿基

77、的正常配對。因此，會使該處基因所表達(dá)出的形狀出現(xiàn)異常，形成變異。</p><p>　　1.1.3 紫外線誘變技術(shù)的應(yīng)用情況</p><p>　　紫外線是一種使用最早、沿用最久、應(yīng)用最廣、效果明顯的物理誘變劑。它的誘變率高，而且不易回復(fù)突變。在工業(yè)微生物育種史上曾經(jīng)發(fā)揮過極其重要的作用，迄今仍然是微生物育種中最常用和有效的誘變劑之一。 </p><p>　　齊秀蘭等

78、[3]以妥布霉素產(chǎn)生菌黑暗鏈霉菌ATCC17920為出發(fā)菌株,經(jīng)紫外線處理,獲得一株產(chǎn)量較高且穩(wěn)定的菌株UV259,其效價比原株提高92.3%。周建琴等[4]用康樂霉素(K2C)產(chǎn)生菌的自然突變株ST291為出發(fā)菌株,采用UV誘變和自然分離純化的方法,篩選出1株突變株U102S24。發(fā)酵條件優(yōu)化后,5噸罐上K2C效價比ST291提高460多倍。王筱虹等[5]用UV照射紅霉素產(chǎn)生菌紅色鏈霉菌的原生質(zhì)體,得到比對照菌株效價提高225.8%的

79、高產(chǎn)菌株。值得注意的是,白蘭芳等[12]以紫外線、光復(fù)活處理西羅莫司產(chǎn)生菌,得到正變株UV28261的效價較出發(fā)菌株高2～3倍,且紫外照射后,光復(fù)活處理比暗修復(fù)處理的正變率高得多,這與UV處理菌種后必須暗修復(fù)的傳統(tǒng)觀點(diǎn)恰恰相反。</p><p>　　1.2 酵母菌在廢水處理中的應(yīng)用</p><p>　　1.2.1 酵母菌</p><p>　　酵母菌是一種單細(xì)胞真菌

80、,酵母菌主要分成兩類:（1）發(fā)酵型酵母,是一種只能利用六碳糖進(jìn)行酒精發(fā)酵的酵母；大部分酵母菌是屬于此類；（2）氧化型酵母,它包括假絲酵母、球擬酵母、漢遜酵母等,這類氧化型酵母菌正是水處理所利用的重點(diǎn)對象；因?yàn)樗芾枚喾N有機(jī)物(簡單糖、有機(jī)酸、醇等) ,有的酵母菌種能利用復(fù)雜化合物,因?yàn)檫@類酵母菌體內(nèi)含有特殊的氧化分解酶。所以酵母菌具有很強(qiáng)的代謝能力,在某些條件下還可以凝聚沉降,由于其菌體較大,易于沉降,可以像活性污泥工藝一樣運(yùn)行和管理

81、；另外,它們在快速分解有機(jī)污染物的同時,能獲得酵母蛋白,既消除了環(huán)境污染,又進(jìn)行綜合利用,形成良性的生態(tài)循環(huán),為造福人類作出有益貢獻(xiàn)[6]。</p><p>　　1.2.2 工業(yè)用酵母菌的分類</p><p>　　工業(yè)上常用的酵母菌有以下幾種：釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、卡爾斯伯酵母（Saccharomyces carlsbergensis）、異常漢遜氏

82、酵母(Hansenula anomala)、球擬酵母(Toruiopsis)、假絲酵母(Candida)、畢赤氏酵母(Pichia)、紅酵母(Rhodotorula)、棉病針孢酵母（Nematspora gossypii）、白地霉(Geotrichum candidum)。</p><p>　　1.2.3 酵母菌菌株的篩選</p><p>　　酵母菌是廣泛存在于石油污染環(huán)境中的一大類真菌

83、，具有耐酸、耐高滲透壓、生長快、代謝效率高的特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，相比于細(xì)菌酵母菌對某些難降解物質(zhì)及有機(jī)物質(zhì)具有較強(qiáng)的分解能力。并且在降解強(qiáng)疏水性物質(zhì)如PAH時， 酵母菌相對其他微生物具有較強(qiáng)的優(yōu)勢。因此，想要得到好的廢水處理效果，酵母菌菌株的篩選是很重要的。許多研究者在進(jìn)行酵母菌處理廢水實(shí)驗(yàn)之前都是經(jīng)過了精心挑選才選定菌種投入實(shí)驗(yàn)的。汪嚴(yán)明從冀東油田鉆井現(xiàn)場采集的受鉆井廢水污染的土壤樣品中篩選到兩株具有降解石油烴的能力的酵母菌(Wicker

84、ham-iella domercqii和Candidaboidinii)[7]。實(shí)驗(yàn)室選用熱帶假絲酵母（O2和G1菌株）進(jìn)行此次實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　1.2.4 酵母菌在廢水處理中的應(yīng)用</p><p>　　酵母菌在很久以前就得到了應(yīng)用，早在幾千年前，人類就開始用酵母發(fā)酵面包和酒類，在發(fā)酵面包和饅頭的過程中面團(tuán)中會放出二氧化碳。隨著人類對酵母菌特性的認(rèn)識不斷加深,人類對酵母菌的開發(fā)

85、和利用也日趨全面和深入,并開發(fā)出以酵母菌為核心技術(shù)的新型污水處理新技術(shù),該技術(shù)是集污水處理、能源回收等多功能為一體的污水綜合處理技術(shù),全方位體現(xiàn)了可持續(xù)發(fā)展的思想。利用酵母菌處理廢水可以追溯到第二次世界大戰(zhàn)時期,在德國等一些國家,由于蛋白質(zhì)大量缺乏,利用石油特別是有機(jī)廢料如酒精廢水、糖蜜廢水生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白(SCP) 的工作受到一定程度的重視,生產(chǎn)也形成了一定的規(guī)模。到了20世紀(jì)70年代，日本就有人進(jìn)行了利用酵母菌處理廢水的探索性研究。從

86、日本新興起來的使用酵母菌進(jìn)行污水處理，比傳統(tǒng)的活性污泥法工藝具有一定的特異性，效率是活性污泥法工藝的8~10倍。到了90年代，日本就成功地實(shí)現(xiàn)了酵母菌廢水處理技術(shù)的工程應(yīng)用。其一制油廠利用酵母處理高含油廢水，對于平均含油量達(dá)11900 mg/L的廢水，除油率可達(dá)99%[8]。日本西原環(huán)境衛(wèi)生研究所把酵母菌處理定位為高濃度有機(jī)廢水的前處理技術(shù)，提出了酵母菌技術(shù)與活性污泥技術(shù)組合的獨(dú)特</p><p>　　酵母菌作為

87、廢水處理中非常珍貴的菌種資源，它具有良好的耐滲透壓、耐酸和代謝效率高等優(yōu)點(diǎn)，有關(guān)數(shù)據(jù)顯示，某些酵母菌能在水的活度值為0.60~0.70時生存,酵母菌對某些難降解物質(zhì)及有機(jī)毒物具有較強(qiáng)的分解能力。而且它還為含有高氨氮、高硫酸根離子的高濃度有機(jī)廢水的處理提供了較多的手段和方法。</p><p>　　此外，酵母菌的應(yīng)用越來越廣泛，逐漸被利用到更多加工及養(yǎng)殖行業(yè)的廢水處理中，包括工業(yè)乙醇生產(chǎn)、沙拉油制造業(yè)、橄欖油加工行業(yè)

88、以及養(yǎng)豬場廢水的處理[14-16]。但是在國內(nèi)，利用酵母菌的廢水處理技術(shù)還不夠成熟，尚處于研究階段，基本停留在生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的基礎(chǔ)上。從1998年開始國內(nèi)著手進(jìn)行有關(guān)酵母菌處理技術(shù)的研究工作，目前已經(jīng)從色拉油加工廢水、味精廢水、油田廢水、染料廢水等環(huán)境中篩選出了一批酵母菌，有關(guān)色拉油加工廢水、味精廢水的酵母菌處理研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展[17]。</p><p>　　眾多工業(yè)及廢水處理實(shí)例證明，酵母菌污水處理系統(tǒng)

89、比馴化后的活性污泥法工藝無論是在反應(yīng)速率還是污染物去除效率方面都具有很大的優(yōu)勢，所以酵母菌污水處理技術(shù)是值得推廣的。酵母菌污水處理技術(shù)作為一種可持續(xù)發(fā)展的技術(shù)，必將會得到越來越多的應(yīng)用。此項(xiàng)污水處理技術(shù)不僅能大大改善水質(zhì)，將大部分有機(jī)污染物轉(zhuǎn)化成細(xì)胞蛋白，而不是CO2，而且與此同時產(chǎn)生的細(xì)胞蛋白也是人類所難得的寶貴資源，而不是剩余污泥。同時酵母菌對環(huán)境條件的要求相當(dāng)寬松,其優(yōu)越性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了傳統(tǒng)污水處理工藝。</p><

90、;p>　　1.3 研究的目的與意義</p><p>　　呂文洲等人比較系統(tǒng)地分析了影響酵母菌在色拉油廢水處理系統(tǒng)中穩(wěn)定性的各種因素，發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞的疏水性是該高含油廢水處理系統(tǒng)選擇優(yōu)勢菌的最重要因素，而細(xì)胞是否具有乳化作用是影響菌株能否在處理高含油廢水中處于優(yōu)勢地位的另一個重要因素，同時，酵母菌的絮凝性、生長速度等因素也可能不同程度地影響著優(yōu)勢菌的選擇。一些研究表明，當(dāng)疏水性物質(zhì)以水包油的乳化形式在水中存在

91、時,其表面面積增加，微生物可利用性也會上升。乳化劑屬于高分子量表面活性劑,通過乳化或增溶作用可促進(jìn)有機(jī)物的溶解或分散,增大有機(jī)物與降解菌細(xì)胞的接觸面積,提高其可利用性,最終導(dǎo)致其生物可降解性的上升。酵母菌株的乳化能力對于其在生物強(qiáng)化體系中的穩(wěn)定性可能起到重要的作用。因此，利用紫外線對相關(guān)酵母菌菌株進(jìn)行照射，使其誘變以得到疏水性好、乳化能力強(qiáng)、絮凝性好的菌株，此類優(yōu)勢酵母菌能夠進(jìn)一步提高廢水中的有機(jī)物降解速率以及其去除率，從而能夠取得更好

92、的廢水處理效果。此類酵母菌株不僅能夠有效提高廢水中的COD去除率，還能產(chǎn)生能被人類用作資源的細(xì)胞蛋白。</p><p><b>　　材料與方法</b></p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑</p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器</p><p>　　1、基本實(shí)驗(yàn)儀器：燒杯、容量瓶、移液槍、玻璃棒、硬質(zhì)試管、錐

93、形瓶、量筒、玻璃比色皿、離心管、培養(yǎng)皿等；</p><p>　　2、BS224S電子天平；</p><p>　　3、PHS-3C精密pH計；</p><p>　　4、LDZX-50KDS立式壓力蒸汽滅菌器；</p><p>　　5、HZQ-C空氣浴振蕩器；</p><p>　　5、BSC1500Ⅱ-A/B生物安全柜；&

94、lt;/p><p>　　6、philips紫外線燈管（30W）；</p><p>　　7、7200型可見光分光光度計；</p><p>　　8、TBL-40B離心機(jī)。</p><p>　　2.1.2 主要試劑</p><p>　　YPD培養(yǎng)基：10 g蛋白胨、10 g牛肉膏、6 g酵母膏溶于1000 mL水中,pH 調(diào)節(jié)

95、至5.5，使用前經(jīng)120℃滅菌20 min；</p><p>　　YPD固體培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，瓊脂2%，蒸餾水配制，自然pH值，使用前經(jīng)120℃滅菌20 min；</p><p>　　3、0.2 mol/L NaAc溶液：稱取1.6047 g NaAc放入100 mL容量瓶中，加水定容至100 mL；</p><p>　　4、0.2 mol

96、/L HAc溶液：量取2.88 mL冰乙酸倒入250 mL容量瓶中，加水定容至250 mL；</p><p>　　5、醋酸-醋酸鈉緩沖液：取配好的溶液（3）45 mL，溶液（4）205 mL于1000 mL的容量瓶中，加水定容至1000 mL，調(diào)節(jié)pH為4.0；</p><p>　　6、0.4 mol/L NaAc溶液：稱取3.2094 g NaAc放入100 mL容量瓶中，加水定容至10

97、0 mL；</p><p>　　7、0.4 mol/L HAc溶液：量取5.76 mL 冰乙酸倒入250 mL容量瓶中，加水定容至250 mL；</p><p>　　8、醋酸-醋酸鈉緩沖液：取配好的溶液(6)50 mL,溶液（7）200 mL于1000 mL的容量瓶中，加水定容至1000 mL，調(diào)節(jié)pH為3.0；</p><p>　　9、0.001 mol/L Ca

98、Cl2溶液：稱取0.111 g無水氯化鈣，溶于蒸餾水中，移至1000 mL容量瓶中，加水定容至1000 mL,調(diào)節(jié)pH為4.0；</p><p>　　三氯甲烷-甲醇萃取液：各量取50 mL的三氯甲烷和甲醇后混合均勻，儲存于棕色試劑瓶中；</p><p>　　0.9%生理鹽水：稱取9 g NaCl溶于蒸餾水中，移至1000 mL容量瓶中，加水定容至1000 mL備用；</p>

99、<p>　　正十六烷：分析純(AR)，實(shí)驗(yàn)室購買。</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 酵母菌的培養(yǎng)及篩選</p><p>　　從實(shí)驗(yàn)室原有的斜面培養(yǎng)基中選出五個菌株，分別為O2、G1、O3i、W1、O5，將這五個菌株分別接種到無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，無機(jī)鹽培養(yǎng)基需預(yù)先滅菌并向其中加入2

100、mL食用油。放入HZQ-C空氣浴振蕩器中，28℃,175 rpm下?lián)u瓶培養(yǎng)2d。取出錐形瓶，靜置2h后觀察，O2、G1菌液出現(xiàn)明顯乳化現(xiàn)象。因此，本次實(shí)驗(yàn)選取O2、G1為實(shí)驗(yàn)菌株。從斜面培養(yǎng)基中分別接取一環(huán)O2、G1酵母菌至預(yù)先滅菌過的100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，再放入HZQ-C空氣浴振蕩器中，28℃,175 rpm下?lián)u瓶培養(yǎng)2d。</p><p>　　2.2.2 酵母菌的疏水性測定[18]</p&

101、gt;<p>　　O2、G1酵母菌菌株YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的48h菌株，每個菌株的菌液取45 mL于離心管中，放入TBL-40B離心機(jī)中，離心機(jī)的參數(shù)設(shè)置為3000 rpm，離心三分鐘后倒去上清液，加入醋酸-醋酸鈉緩沖液至40 mL再次離心，離心三分鐘后再次倒去上清液，并再加入醋酸-醋酸鈉緩沖液40 mL進(jìn)行離心。將得到的細(xì)胞培養(yǎng)物懸浮于絮凝緩沖液中，調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)物的濃度使得懸濁液的吸光度OD620=2，接著取出4

102、mL懸液于10 mL的帶帽小試管中，用移液槍吸取1 mL正十六烷加入小試管中，放在振蕩器上漩渦振蕩60 s（振蕩30 s后間歇5 s，再繼續(xù)下一個30 s），兩相分離5分鐘后，用移液槍取出下層的水相于玻璃比色皿中在7200型可見光分光光度計上讀出OD620，并記錄下數(shù)值。疏水性計算為：粘附%。（A0為初始吸光度，A1為最后吸光度）。 </p><p>　　2.2.3 酵母菌的絮凝性測定[19]&

103、lt;/p><p>　　O2、G1酵母菌菌株YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的48h菌株，每個菌株的菌液取45 mL于離心管中，放入TBL-40B離心機(jī)中，離心機(jī)的參數(shù)設(shè)置為3000 rpm，離心三分鐘后倒去上清液，加入40 mL去離子水振蕩使粘附在離心管壁的細(xì)胞培養(yǎng)物完全溶于水中，放入離心機(jī)中離心三分鐘后取出倒去上清液，如此清洗兩次后，將得到的細(xì)胞培養(yǎng)物懸浮于絮凝緩沖液中，調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)物的濃度使得懸液的OD620=2，接

104、著取4000微升到比色杯中，漩渦混合20 s，立即翻轉(zhuǎn)5次，置于7200型可見分光光度計上每隔10-30 s讀取OD620值，0 min和20 min時測定菌體懸浮液的OD620分別記作D0和D1。絮凝百分率計算為：絮凝%=。</p><p>　　2.2.4 酵母菌的乳化能力測定[20]</p><p>　　乳化劑的量（g/L）定義為每升廢水處理液中所產(chǎn)生的乳化劑的質(zhì)量；菌體細(xì)胞產(chǎn)生乳化

105、劑的量（菌體）定義為每100個活菌落所產(chǎn)生的乳化劑的量。</p><p>　　乳化劑粗提取：取一定量廢水處理液，放入離心機(jī)，3000 rpm離心四分鐘，取出離心管去上層水樣約50 mL，用25 mL的三氯甲烷-甲醇萃取液萃取2 min，萃取3次，初步分離得到生物乳化劑。</p><p>　　乳化力測定：將初步分離得到的乳化劑以15 mg溶于2 mL蒸餾水中進(jìn)行稀釋，然后取稀釋液2 mL于1

106、0 mL的小試管中，加2 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 3.0）及1 mL正十六烷，再將混合液放在漩渦振蕩器上強(qiáng)烈振蕩后靜置10 min，然后在540 nm下于7200型可見光分光光度計上測定溶液的吸光度值，吸光值乘以稀釋倍數(shù)即可代表乳化能力。</p><p>　　2.2.5 紫外線處理酵母菌細(xì)胞[21]</p><p>　　紫外線誘變輻射條件：</p><p>

107、　　1、紫外燈功率：30W；</p><p>　　2、照射距離：30cm；</p><p>　　3、照射環(huán)境溫度：25℃。</p><p>　　處理：將誘變所需的儀器設(shè)備在滅菌操作臺上滅菌，紫外燈打開預(yù)熱30 min。紫外燈預(yù)熱期間，用移液槍各吸取0.5 mL含有O2、G1菌體的培養(yǎng)基，用無菌生理鹽水分別均稀釋至250 mL（稀釋500倍）。</p>

108、<p>　　UV誘變：將菌液與無菌生理鹽水混合均勻后再吸取5 mL至直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中，放在紫外燈下30 cm處照射。O2、G1兩菌株均設(shè)置三個平行樣。第一批菌株照射10 s，第二批照射20 s，第三批照射40 s，照射完畢后關(guān)閉紫外燈。</p><p>　　菌種再培養(yǎng)：將經(jīng)紫外線照射的處理樣品分別劃線接種到高溫滅菌后的平板培養(yǎng)基中，并標(biāo)明記號。將培養(yǎng)基正放入恒溫培養(yǎng)箱中30 min后再倒置，2