蕪菁胚發(fā)育相關基因BcNAC2的功能分析.pdf

1、花的發(fā)育是植物發(fā)育過程中最引人注目的事件，花芽的形成意味生殖生長的開始(盧海宇等，2009)。Coen和Meyerowitz(1991)提出了花器官發(fā)育的ABC模型，這是植物發(fā)育分子生物學研究領域里程碑式的重大突破，也為人們打開了一扇通向花器官多樣性研究的大門。在蕓薹屬作物中，雄性不育現(xiàn)象普遍存在，并且應用蕓薹屬作物的雄性不育性，利用雜種優(yōu)勢，提高產(chǎn)量，但雌性不育現(xiàn)象在蕓薹屬作物中卻鮮有報道。本研究以蕪菁(Brassica campes

2、tris L.ssp.rapifera(Matzg)Sinsk，syn.B.rapa L.)雌蕊退化突變體tpa(turnip pistil abortion)及其野生型(可育株)雌蕊和胚發(fā)育轉錄組分析中發(fā)現(xiàn)的基因BcNAC2為研究對象，通過PCR擴增方法對蕪菁BcNAC2的cDNA全長和DNA全長進行了分離、鑒定及蛋白質結構和功能的預測；從NCBI上搜索到相關的NAC蛋白進行同源比對，在此基礎上構建分子進化樹；采用半定量RT-PCR(

3、Reverse transcriptase polymerase chain reaction)技術分析該基因在蕪菁不同發(fā)育階段的營養(yǎng)組織與生殖組織中的表達狀況；通過組織原位雜交的方法檢測授粉受精后該基因的表達部位；構建了蕪菁反義BcNAC2的植物表達載體，用中國白菜的變種菜心(Brassicacampestris L.ssp.ckinensis var.utilis Tsen et Lee)為材料進行遺傳轉化，通過遺傳轉化獲得轉基因植

4、株，從分子生物學方面對轉基因植株進行檢測和分析。研究結果如下：
　　 (1)在已有的cDNA-AFLP差異片段的基礎上，采用同源序列克隆技術獲得與雌蕊發(fā)育相關的蕪菁NAC轉錄因子--BcNAC2的cDNA和DNA序列全長。序列分析表明，BcNAC2的cDNA序列全長為2080 bp，最大ORF框為1683 bp，編碼560個氨基酸序列。其DNA序列全長中包含6個外顯子和5個內(nèi)含子，外顯子-內(nèi)含子交接處序列遵循GT-AG的普遍規(guī)律

5、，屬于的剪接體識別序列。其中內(nèi)含子的長度依次為67 bp、102 bp、269 bp、81 bp和83 bp。對推導的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該序列第9-159個氨基酸編碼NAC結構域。利用SMART數(shù)據(jù)庫進一步分析發(fā)現(xiàn)，其為NAM亞家族蛋白。BcNAC2的二級結構包含19.64％的α-螺旋，15.00％的β-折疊和65.36％的無規(guī)則卷曲結構，三級結構呈馬鞍形。此外，與擬南芥的NAC2蛋白的功能結構域中的motif進行比較發(fā)現(xiàn)，蕪菁BcN

6、AC2與擬南芥AtNAC2功能結構域內(nèi)的特征序列有顯著的差異，主要區(qū)別在磷酸化位點上。在蕪菁BcNAC2蛋白的NAC結構域內(nèi)，發(fā)現(xiàn)有2個N-糖基化位點(79～82，103～106氨基酸)，4個蛋白激酶C磷酸化位點(83～85，87～89，95～97，110～112氨基酸)，5個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(18～21，42～45，71～74，95～98，137～140氨基酸)，2個N-酰基化位點(80～85，109～114氨基酸)。而在擬南芥

7、NAC2蛋白的結構域中共發(fā)現(xiàn)有2個N-糖基化位點(57～60，79～82氨基酸)，1個環(huán)腺苷酸和鳥苷酸依賴的蛋白磷酸化激酶(53～56氨基酸)，3個蛋白激酶C磷酸化位點(42～44，61～63，72～74氨基酸)，3個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(30～33，37～40，72～75氨基酸)，2個酪氨酸激酶磷酸化位點(11～17，11～18氨基酸)，3個N-酰基化位點(4～9，58～63，85～90氨基酸)。由此可知，蕪菁BcNAC2蛋白和擬南

8、芥NAC2蛋白結構域內(nèi)的特征序列差異較為明顯，序列的差異是否會導致基因功能的不同，還需要后續(xù)進一步的研究。
　　 (2)從NCBI上搜索下載相關的30個NAC蛋白與蕪菁BcNAC2進行同源比對，構建了分子進化樹。結果表明，BcNAC2與擬南芥的AtNAC2、煙草的TERN和大豆的GmNAC6的親緣關系較近，可以歸為一類，均屬于NAM亞家族。其中BcNAC2與AtNAC2的親緣關系更近，說明同科植物的親緣關系較近。通過對NAM亞家

9、族的蛋白進行序列比對發(fā)現(xiàn)，在N端的NAC保守結構域處相似性較高，而在C端序列呈現(xiàn)多樣性，同源性較低，表明不同的NAC轉錄因子可能通過不同的C-端序列調(diào)控轉錄活性，符合NAC轉錄因子的結構特點。
　　 (3)采用半定量RT-PCR分析和組織原位雜交等兩種方法分析BcNAC2的表達特性。半定量RT-PCR分析了蕪菁BcNAC2在蕪菁不同發(fā)育階段中的表達動態(tài)，發(fā)現(xiàn)該基因有組成型表達特點，其中在小蕾、中蕾中的表達量較高，而在授粉受精后的

10、嫩角果中，授粉后8天的嫩角果表達量最高。該基因不僅在前期營養(yǎng)器官中能正常表達，而且在后期的種子或胚的形成過程中也有較高豐度的表達，暗示該基因在植物整個生長發(fā)育過程中都可能發(fā)揮著重要的作用。組織原位雜交分析結果表明，BcNAC2在授粉后4天胚珠的胚囊部位有較高的表達，而授粉8天的胚珠內(nèi)部也有較高豐度的表達，上述結果與半定量的分析結果基本一致，由此推測，BcNAC2參與了種子或胚的發(fā)育形成過程。
　　 (4)在正確分離反義BcNAC