戊四氮誘導發(fā)育鼠癲

1、<p><b>　　戊四氮誘導發(fā)育鼠癲</b></p><p>　　【關鍵詞】 戊四 </p><p>　　摘要 :目的 探討戊四氮誘導發(fā)育鼠癲持續(xù)狀態(tài)（SE）后海馬結構的突觸重建以及NMDA受體在其中的作用。 方法 利用圖像分析儀測定戊四氮誘導的發(fā)育鼠癲持續(xù)狀態(tài)模型及用NMDA受體拮抗劑MK-801治療后海馬結構內CA3區(qū)及齒狀回內分子層突觸素（p3

2、8）的陽性免疫反應產物的光密度值（A）。 結果 不同日齡SD大鼠SE后海馬結構內各部p38陽性免疫反應產物光密度值較對照組顯著增加，尤以CA3區(qū)苔蘚纖維層和齒狀回分子層內帶為甚;MK-801可顯著減少p38的表達。 結論 癲持續(xù)狀態(tài)后存在突觸重建現象，一方面是癲發(fā)作的結果，另一方面也可能是導致癲反復發(fā)作的分子學基礎;在此過程中NMDA受體發(fā)揮著重要的作用。 </p><p>　　關鍵詞 :發(fā)育鼠;癲持續(xù)狀態(tài);

3、突觸素;齒狀回;MK-801 </p><p>　　Abstract:Objective To study the synaptic reorganization of hippocampal formation after pentylenetetrazol-induced sta-tus epilepticus in developing rats and the effect of NMDA recepto

4、r antagonist MK-801on it.Methods The optical density（A）of synaptophysin（p38）immunoreactive product was examined by image pattern analysis in the hippocampus of developing rats associated with pentylenetetrazol-induced st

5、atus epilepticus and MK-801treatment.Results The A of p38positive im-munoreactive product in hippo</p><p>　　Key words:developing rats;status epilepticus;synaptophysin;dentate gyrus;MK-801 </p><p&g

6、t;　　癲是最常見的神經系統疾病之一，是由于腦細胞的突然放電所引起反復性驚厥發(fā)作。其中癲持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）因能夠造成嚴重的全身性和神經元的損傷而受到重視。近年來，在不同的動物癲模型及人類癲灶的形態(tài)學研究中發(fā)現了突觸重建現象，被認為是癲發(fā)生后中樞神經系統可塑性變化的重要反映［1］ 。突觸素（synaptophysin，p38）系一相對分子質量為38000的鈣結合糖蛋白，位于小突觸囊泡上，在神經元胞體合成

7、后被轉運至軸突終末貯存。p38作為突觸囊泡的一種特異標志性蛋白，其密度和分布可間接反映體內突觸的數量和分布情況，從而反映出突觸結構和功能的變化，與突觸重建密切相關［2］ 。 </p><p>　　許多研究表明，成年大鼠在SE發(fā)作后海馬等結構中存在明顯的突觸重建現象，而本研究建立不同年齡幼鼠戊四氮（pentylenetetrazol，PTZ）致SE模型，采用免疫組織化學方法動態(tài)觀察p38在發(fā)育鼠海馬內的表達，并研究

8、應用非競爭性N-甲基-D-天門冬氨酸受體拮抗劑MK-801對其表達的影響，以探討發(fā)育期致動物海馬突觸功能、突觸重構變化過程及NMDA受體在突觸重建中的作用。 </p><p><b>　　1 材料和方法 </b></p><p>　　1.1 試驗動物和試劑 </p><p>　　1.1.1 實驗動物 健康SD大鼠7天、14天、21天、28天4個

9、日齡組，雌雄不限，各組均為54只，由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。隨機分為癲持續(xù)狀態(tài)組（SE組）、MK-801治療組（MK-801組）和對照組（NS組），每組各6只。 </p><p>　　1.1.2 試劑 鼠抗p38單克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司產品;SP免疫組化染色試劑盒，美國ZYMED公司產品;PTZ、MK-801為美國Sigma公司產品。 </p><p><b>

10、;　　1.2 方法 </b></p><p>　　1.2.1 癲持續(xù)狀態(tài)模型的建立和分組處理 各日齡大鼠的SE組與MK-801組腹腔內注射PTZ（80mg.kg，用生理鹽水稀釋成100g.L），發(fā)作開始時的表現按Lado幼鼠癲發(fā)作分級標準［3］ 評價，均達到3.5～8級發(fā)作，呈癲持續(xù)狀態(tài)，發(fā)作1h2組均給予地西泮腹腔內注射（10mg.kg）以終止發(fā)作，MK-801組給地西泮同時腹腔內注射MK-801，

11、劑量為1mg.kg（用生理鹽水稀釋成0.5g.L）。各日齡大鼠NS組用與PTZ等體積的生理鹽水腹腔內注射，1h后亦給予同劑量的地西泮腹腔注射。所有大鼠均在同一實驗室和動物中心操作和喂養(yǎng)，以保持喂養(yǎng)、光照、噪聲等條件相同，減少外界干擾造成的差異。 </p><p>　　1.2.2 組織切片的制備 4個日齡組分別于發(fā)作后第7、14、28天（每一時間點各組均為6只）腹腔內注射10%水合氯醛（0.35ml.kg）麻醉，4

12、%多聚甲醛左心灌注固定取腦。在海馬部位做連續(xù)冠狀冰凍切片，切片厚30μm，每隔2張取1張切片，每例標本（雙側海馬結構）取切片不少于8張。 </p><p>　　1.2.3 免疫組織化學染色 以鼠抗p38單克隆抗體（1∶100）作為一抗，采用SP法行p38免疫組織化學染色，用DAB和H 2 O 2 呈色，自來水沖洗，貼片，脫水，透明，封片。棕黃色著色為陽性。陰性對照試驗以PBS代替一抗，其余染色步驟相同。 <

13、/p><p>　　1.2.4 結果判定 p38免疫反應產物的標記強度以光密度值（A）表示，應用LEICA Qwin圖像處理與分析系統（德國）測定齒狀回分子層內帶與海馬CA3區(qū)苔蘚纖維層等部位，每個部位測定10個視野的A值（分別為A1、A2……A10），同時測定同一張切片的胼胝體的A值（A 0 ）作為背景，計算出校正A值（CA值）:CA=（A1+A2+……+A10）.10-A 0 。每例標本被檢各區(qū)測6張切片，該例標本

14、的p38免疫反應產物A值為各片CA的平均值。 </p><p>　　1.3 統計學處理 所得結果以ˉx±s表示，應用SPSS11.5軟件進行統計學處理，采用單因素方差分析（ANOVA）進行顯著性差異分析，檢驗水準:α=0.05。 </p><p><b>　　2 結果 </b></p><p>　　2.1 行為學觀察 SE組與

15、MK-801組大鼠注射PTZ后1～2min進入潛伏期，由自由活動狀態(tài)逐漸轉為安靜、呼吸加快，很快出現癲發(fā)作，漸次出現連續(xù)點頭、前肢陣攣、后退、摔倒;7～8級發(fā)作的大鼠則表現為狂奔嘶叫、全身強直-陣攣性發(fā)作，同時伴有全身青紫。NS組大鼠無行為學改變。 </p><p>　　2.2 p38免疫反應產物 </p><p>　　2.2.1 NS組 NS組切片的海馬結構內p38免疫反應產物呈板層樣

16、分布，神經氈內免疫反應產物呈特異性點狀或顆粒狀沉積，多為細顆粒狀沉積，神經元胞質、膠質細胞、血管及白質不被染色。在海馬CA3區(qū)苔蘚纖維層內，深染的顆粒狀免疫反應產物較為均勻分布，整體呈月牙形（圖1A）。在齒狀回內分子層內帶染色最深，顆粒細胞輪廓邊緣也有點狀反應產物沉積（圖1B）。陰性對照實驗切片無特征性免疫反應產物。各日齡組切片經分析比較，14、21與28日齡鼠的p38的表達逐漸增加，且兩兩比較有顯著性差異（P&lt;0.05）

17、，但35、42、49、56日齡鼠較28日齡鼠均無顯著性差異（P&gt;0.05）。圖2示NS組不同日齡鼠p38的表達趨勢。 </p><p>　　圖1 海馬結構內突觸素p38免疫反應產物（略） </p><p>　　A:箭頭示CA3區(qū)苔蘚纖維層（免疫組化染色，×100）B:箭頭示齒狀回分子層內帶（免疫組化染色，×40） </p><p>

18、;　　圖2 NS組不同日齡鼠p38的表達趨勢（略） </p><p>　　2.2.2 SE組與MK-801組 SE組海馬結構內p38免疫反應產物的分布特征無明顯變化。定量結果顯示，各日齡組在癲發(fā)作后各個時間點海馬CA3區(qū)苔蘚纖維層、齒狀回分子層內帶p38免疫反應產物CA值顯著增加（P&lt;0.05），其中均以發(fā)作后14天增加達最高峰。 </p><p>　　MK-801組齒狀回

19、分子層內帶及CA3區(qū)苔蘚纖維層p38免疫反應產物CA值較各日齡SE組各個時間點均顯著降低（P&lt;0.01），見表1。 </p><p>　　表1 3組大鼠海馬結構內p38免疫反應產物CA的比較（略） </p><p>　　與NS組比較:*P&lt;0.05，**P&lt;0.01;與PTZ組比較:#P&lt;0.05，##P&lt;0.01

20、</p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>　　目前，對癲反復發(fā)作的病因的說法很多，但顆粒細胞的苔蘚纖維異常發(fā)芽及伴隨的突觸重建已被認為是其細胞機制之一。即神經系統因癲或其他因素作用受損后，現存的神經元可通過軸突出芽形成不同的徑路與原有的突觸后位點或新的突觸后位點發(fā)生接觸，形成新的突觸。同時，平時處于休眠狀態(tài)的側支和突觸聯系被激活，從而完成神經回

21、路的改造和突觸的重組，由此導致突觸可塑性發(fā)生變化。 </p><p>　　p38于1985由Jahn等［4］ 從大鼠腦突觸囊泡中提取，它幾乎存在于所有神經終末的突觸囊泡膜上，是一種重要的囊泡膜標志蛋白，參與多種突觸相關活動，如參與Ca 2+ 依賴性神經遞質釋放過程，并與長時程增強（long-term potentiation，LTP）的誘導與維持有關［5］ 。免疫組織化學顯示，顆粒樣p38免疫反應產物基本上反映了

22、被檢區(qū)突觸的分布和密度。經電鏡證實，光鏡下標記的p38顆粒樣結構實際上就是成簇的囊泡。由于p38含量與突觸密度呈正相關，因此借助圖像分析系統測量p38免疫產物的平均光密度值可推測突觸數量或密度，從而反映出突觸結構和功能的變化，并達到在光鏡水平分析超微結構的目的［6］ 。以往研究證明，正常大鼠中樞突觸發(fā)育過程主要在生后3周內完成［7］ 。沈麗等［8］ 對大鼠海馬突觸發(fā)育可塑性進行研究發(fā)現大鼠海馬CA1區(qū)生后20天至30天突觸數目仍有所增長

23、，說明CA1區(qū)突觸數目增殖可持續(xù)至生后1個月，但20天突觸較30天突觸幼稚。本試驗結果顯示NS組28日齡幼鼠p38的表達較14、21日齡有顯著性差異（P&lt;0.01），但比較35、42、49、56日齡均無顯著性差異</p><p>　　由于膠質細胞不表達p38，因此實驗所見的p38增加可能主要由于神經元活動所致。但是p38免疫活性增高的機制目前仍不十分清楚，許多研究表明癲過程中常伴有海馬結構內選擇性神

24、經元丟失［9］ ，神經元的丟失可使下位突觸空缺，存活的神經元的軸突在失去靶器官后，就會出現軸突的出芽和形成許多側支，填補丟失神經元留下的空間，并與其他神經元建立新的突觸聯系，構成異常的神經網絡，因此其突觸前囊泡的數量可能增加，另外也可能與突觸前膜功能代償性增加有關。Chen等［10］ 在大鼠局部皮質注射海人酸的腦區(qū)也發(fā)現p38免疫組化反應增強和神經元脫失，提示p38表達增強是神經元損傷的結果。綜合既往研究，我們認為SE發(fā)作與p38表達增

25、強之間關系可能為:①癲發(fā)作后大量Ca 2+ 內流，激活了Ca 2+ .CaM依賴性蛋白激酶系統，促進興奮性氨基酸釋放［11］，p38蛋白正是Ca 2+ .CaM依賴性蛋白激酶［12］ 。②驚厥后NMDA受體活性的增高，谷氨酸過量釋放后，一方面介導興奮毒性損害，導致神經元壞死或凋亡;另一方面也啟動了一些神營養(yǎng)因子的表達，特別是腦源性神經營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrop</p><p>　　本

26、試驗發(fā)現，SE發(fā)作后p38免疫反應產物的增加一直持續(xù)到試驗終點28天，推測海馬p38免疫反應產物增加，一方面是癲發(fā)作的結果，另一方面也可能是癲慢性反復發(fā)作的分子病理學基礎。考慮由于當出芽側支回返時，可穿過顆粒細胞層到達齒狀回分子層或穿過CA3錐體細胞層到達CA3始層形成突觸聯系，海馬結構的突觸調整，構成了密亂的反復興奮環(huán)路，激動信號在環(huán)路中不斷振蕩，自我放大和增強，可導致癲反復發(fā)作。NMDA受體是廣泛分布于中樞神經系統的谷氨酸敏感離子通

27、道受體，在癲的發(fā)生、發(fā)展和維持中起著重要的作用。它是一種具有許多不同變構調控位點并對Ca 2+ 高度通透的配體門控離子通道，它不僅通過調節(jié)鈣離子內流，保持神經元正常的生理功能，同時與中樞神經系統的發(fā)育、可塑性密切相關，并參與缺氧缺血性腦損傷、癲和大腦退行性變等損傷的病理生理過程［17］ 。MK-801是一個強有力、非競爭性的NMDA型受體拮抗劑，富親脂性，易于通過血腦屏障，能有效地、選擇性地作用于具有此受體的海馬神經細胞，而且NMDA受

28、體上MK-801非競爭性拮抗部位在不成熟大鼠比成年大鼠敏感［18］ 。MK-801結合于與受體耦聯的離子通道內部，從而</p><p>　　本實驗動態(tài)觀察了PTZ致癲持續(xù)狀態(tài)后海馬突觸素的改變，結果說明在生理狀態(tài)下SD大鼠腦內p38在生后28天即達高峰;而SE發(fā)作后突觸素表達顯著增強，提示SE發(fā)作后海馬等結構內存在神經元的突觸重建現象，因而這些結構的神經可塑性發(fā)生改變，并由此可能導致神經生理功能的改變，繼而可能成

29、為癲反復發(fā)作的解剖基礎。 </p><p><b>　　參考文獻 : </b></p><p>　?。?］ 羅煥敏.海馬結構―――從形態(tài)、功能到可塑性、衰老性變化［J］.神經解剖學雜志，1996，12（2）:177-184. </p><p>　?。?］ Proper EA，Oestreicher AB，Jansen GH，et al.Imm

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