高產(chǎn)靈菌紅素培養(yǎng)條件優(yōu)化[畢業(yè)設(shè)計(jì)]

1、<p>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)</p><p><b>　?。ǘ?屆）</b></p><p>　　高產(chǎn)靈菌紅素培養(yǎng)條件優(yōu)化</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級 生物工程 </p&

2、gt;<p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p>　　摘要: 靈菌紅素(prodigiosins，PG)是一些放線菌、沙雷氏菌及其它細(xì)菌產(chǎn)生

3、的具有重要生物活性的次級代謝產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)通過單因子實(shí)驗(yàn)，對沙雷氏菌發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，找到一個(gè)優(yōu)于現(xiàn)有配方的培養(yǎng)基配比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出利用2%的花生為培養(yǎng)基，較甘油蛋白胨培養(yǎng)基，降低了91.1%的生產(chǎn)成本。</p><p>　　關(guān)鍵詞: 靈菌紅素； 沙雷氏菌； 發(fā)酵工藝優(yōu)化</p><p>　　Abstract：Prodigiosins with important biological

4、activity secondary metabolites are produced by a number of Actinomycetes, Serratia and other bacteria. Through the investigation of single-factor experiment design, Conditions of fermentation of Prodigiosins were inves

5、tigated, The results of the use of 2% of peanuts litter than Glycerine-Protein Culture, reducing 91.1% of the culture of the cost of production.</p><p>　　Keywords： prodigious；Serratia; fermentation conditio

6、ns</p><p><b>　　目 錄</b></p><p>　　摘要…………………………………………………………………………………………………… Ⅰ </p><p>　　Abstract………………………………………………………………………………………………… Ⅱ</p><p>　　1 緒論……………

7、………………………………………………………………………………… （1）</p><p>　　1.1 靈菌紅素的基本性質(zhì)……………………………………………………………………… （1）</p><p>　　1.2 選題的背景及意義…………………………………………………………………………（1）</p><p>　　1.3 靈菌紅素的研究動(dòng)態(tài)…………………………………

8、……………………………………（1）</p><p>　　1.3.1 最新應(yīng)用研究動(dòng)態(tài)………………………………………………………………… （1）</p><p>　　1.3.2 生產(chǎn)現(xiàn)狀…………………………………………………………………………… （2）</p><p>　　1.4 實(shí)驗(yàn)的目的、內(nèi)容和難點(diǎn)………………………………………………………………… （3）&

9、lt;/p><p>　　2 方法與材料……………………………………………………………………………………… （4）</p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料…………………………………………………………………………………… （4）</p><p>　　2.1.1 菌種…………………………………………………………………………………………（4）</p><

10、p>　　2.1.2 主要儀器與試劑……………………………………………………………………………（4）</p><p>　　2.1.3 培養(yǎng)基………………………………………………………………………………………（4）</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法…………………………………………………………………………………………（4）</p><p>　　2.2.1

11、 種子的培養(yǎng)與優(yōu)化…………………………………………………………………………（4）</p><p>　　2.2.2 種子的擴(kuò)大培養(yǎng)……………………………………………………………………………（4）</p><p>　　2.2.3 紅色素的提取………………………………………………………………………………（5） 2.2.4 靈菌紅素含量測定………………………………………………………………

12、…………（5）</p><p>　　2.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)…………………………………………………………………………………（5）</p><p>　　3 結(jié)果與分析…………………………………………………………………………………………（8）</p><p>　　3.1 單因素實(shí)驗(yàn) …………………………………………………………………………………（8）</p>

13、;<p>　　3.2 生產(chǎn)成本計(jì)算……………………………………………………………………………… （13）</p><p>　　4 結(jié)論 ………………………………………………………………………………………………（14） </p><p>　　參考文獻(xiàn)………………………………………………………………………………………… （15） 致謝…………………………………………………………

14、…………………………………… （17）</p><p><b>　　1 緒論</b></p><p>　　1.1 靈菌紅素的基本性質(zhì)</p><p>　　靈菌紅素(prodigiosins，PG)是一類天然紅色素的總稱， 1929年由Amark等研究Serratia生長時(shí)發(fā)現(xiàn)，包括prodigioSin，prodigio Sin 25-C，me

15、tacyc1oprodigiosin (MP)desmethoxyprodigiosi和uncedy1prodigiosin(UP)等，通常都有3個(gè)吡咯環(huán)組成的甲氧基吡咯骨架結(jié)構(gòu)[1-2]。靈菌紅素屬于脂溶性色素，易溶于甲醇和丙酮，不溶于水，在極性較強(qiáng)的酸性和堿性水溶液中微溶，在極性較弱的有機(jī)溶劑如乙醚或石油醚中微溶或不溶；靈菌紅素對溫度穩(wěn)定，一般在90度以下都很穩(wěn)定，但受pH的影響較大，酸性環(huán)境中能保持較長的時(shí)間，堿性條件下則損失較大

16、；A1，Ca，K ，Ba 等金屬離子對靈菌紅素的穩(wěn)定性影響不大，Zn 有使靈菌紅素增色的作用，Mg 和Mn 對靈菌紅素有一定的破壞作用，Pb 可以絡(luò)合靈菌紅素，使之成為沉淀；白光和藍(lán)光使靈菌紅素發(fā)生光解，在紅光和遠(yuǎn)紅光下靈菌紅素則不會降解[3]。</p><p>　　1.2 選題的背景及意義</p><p>　　隨著社會的發(fā)展和人們生活水平的提高，合成色素對人體健康的危害越來越引人注目。

17、大量的研究報(bào)告指出，基本所有的合成色素都不能向人體提供營養(yǎng)物質(zhì)，一些色素還會危害人體健康。其中的危害包括一般毒性、致瀉性、致突性（基因突變）和致癌性。因此合成色素作為食品添加劑的用量越來越少，甚至被眾多國家禁止使用。而天然色素具有安全、無毒、色澤亮麗誘人，尤一些天然色素本身就是人們?nèi)粘ｏ嬍车某煞?，有一定的營養(yǎng)價(jià)值和藥理保健作用，因此倍受人們的矚目[4]。</p><p>　　現(xiàn)今，天然色素(PG)的種類并不多，靈

18、菌紅素就是天然色素之一。靈菌紅素有一定的免疫活性，如抑制真菌、細(xì)菌和霉菌等功效，且具有抗腫瘤作用，因此具有很大的藥用價(jià)值。除此之外，靈菌紅素在紡織染色方面也比其他染料有優(yōu)勢，受到科研工作者和企業(yè)家的極大關(guān)注，具有創(chuàng)造巨大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的潛力。</p><p>　　目前，主要是通過微生物發(fā)酵來獲得靈菌紅素，能產(chǎn)生靈菌紅素的微生物主要有鏈霉菌屬（Streptomyces）、沙雷氏菌屬（Serratia）和假單胞菌（pseu

19、domonas）等種屬[5-6]。其中又以沙雷氏菌屬生產(chǎn)靈菌紅素最受關(guān)注，報(bào)道也最多。但是，利用微生物發(fā)酵的靈菌紅素還存在很多問題，例如產(chǎn)靈菌紅素的菌種不穩(wěn)定，產(chǎn)量較低和成本偏高等。</p><p>　　1.3 靈菌紅素的研究動(dòng)態(tài)</p><p>　　1.3.1 最新應(yīng)用研究動(dòng)態(tài)</p><p>　　近年來靈菌紅素的在醫(yī)學(xué)、環(huán)境治理，紡織染色以及食品上的應(yīng)用越來越廣

20、泛，具有很高的利用價(jià)值。</p><p>　　根據(jù)靈菌紅素的抗腫瘤、免疫抑制活性、抗菌、抗瘧疾活性等作用，在醫(yī)學(xué)上有巨大的發(fā)展?jié)摿?。在抗腫瘤方面，靈菌紅素對比起另外一些化學(xué)療法藥劑，如環(huán)磷琉胺(cyclophosphamide)具有低細(xì)胞毒作用，只有當(dāng)濃度大于300nM時(shí)才具有明顯的淋巴細(xì)胞抑制作用。而后者在其有效濃度時(shí)毒性已非常高[7]。</p><p>　　第一、靈菌紅素能引發(fā)Cu2+

21、誘導(dǎo)的雙鏈DNA的裂解與其分子中A環(huán)的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，完整的雙吡咯環(huán)發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)是靈菌紅素顯現(xiàn)銅介導(dǎo)的核酸酶活性的關(guān)鍵之一[8]。</p><p>　　第二、靈菌紅素可以破化細(xì)胞內(nèi)的線粒體，高爾基體和溶酶體對細(xì)胞質(zhì)的pH梯度，降低細(xì)胞內(nèi)ATP水平[9-10]。這是由于靈菌紅素可以在這些細(xì)胞器的膜上起到離子孔（Ionophore）的作用，而抵消H+的同向轉(zhuǎn)運(yùn)。</p><p>　　第三、靈菌紅素

22、可以激活細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞凋亡途徑。一方面，靈菌紅素激活前半胱天冬酶8（Pro-Caspase 8），繼而啟動(dòng)了細(xì)胞內(nèi)半胱天冬酶依賴的細(xì)胞凋亡。另一方面，它也可以使線粒體釋放其細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（Apoptosis inducing factor，簡稱AIF）而觸發(fā)非半胱天冬酶依賴的細(xì)胞凋亡。除此之外，靈菌紅素還會通過一系列誘導(dǎo)或抑制的作用達(dá)到抑制細(xì)胞周期的目的。另外，根據(jù)Zhang等研究中，靈菌紅素還可以促進(jìn)細(xì)胞集結(jié)，阻止癌細(xì)胞對周遭組織的入侵

23、或是遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[11-12]。</p><p>　　在環(huán)境治理方面，據(jù)韓國科學(xué)家對海洋微生物的研究中，發(fā)現(xiàn)靈菌紅素對消除赤潮有良好的作用[13]。這一發(fā)現(xiàn)，能有效治理水體由富營養(yǎng)化引起的赤潮，并且是使用生物天然的治理方法，具有高度的安全性，對環(huán)境的修復(fù)和保持有重大的意義。</p><p>　　在紡織染色方面，靈菌紅素染色效果比其他合成色素有優(yōu)勢。鐘綿國等對靈菌紅素染色的研究，發(fā)現(xiàn)靈菌紅素比其

24、他染色材料更容易染色，并且染色色度更鮮艷，并且不易洗脫。還有根據(jù)靈菌紅素的抗菌性，對被染色的材料還有一定的抑菌性。這在紡織上有很大的發(fā)展空間[14]。</p><p>　　在食品方面，色素是一種食品添加劑，這直接影響人們的健康。天然色素作為食品添加劑具有較高的安全性，無毒、色澤亮麗誘人，尤其是一些天然色素本身就是人們?nèi)粘ｏ嬍车某煞?，有一定的營養(yǎng)價(jià)值和藥理保健作用，備受各界的關(guān)注。</p><p

25、>　　1.3.2 生產(chǎn)現(xiàn)狀</p><p>　　20世紀(jì)60年代早期，Rapoport等首先描述了靈菌紅素化學(xué)合成的全過程，但是比較復(fù)雜和困難。1996年D’Alessio [15]等提出了新的制備PG類似物的方案，先將C環(huán)和B環(huán)相連然后再和A環(huán)結(jié)合即得PG前體物質(zhì)，步驟簡單，合成效率明顯提高，但不能成功合成天然的十二烷基PG。</p><p>　　利用化學(xué)合成法不能合成純天然的PG

26、，因此，人們寄希望于微生物發(fā)酵生產(chǎn)，并且，研究多為使用沙雷氏菌發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素。</p><p>　　王學(xué)東[7]對野生黏質(zhì)沙雷菌株進(jìn)行紫外誘變處理，篩選獲得的鏈霉素抗性菌株搖瓶產(chǎn)量達(dá)到120 mg/L，發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)160 mg/L。</p><p>　　Tao 等[16]利用紫外誘變獲得了一株沙雷菌株 B6，以葡萄糖為初始碳源，流加甘油為靈菌紅素合成誘導(dǎo)物，所開發(fā)的流加發(fā)酵工藝不僅可防止

27、菌體過早自溶，而且可部分消除靈菌紅素產(chǎn)物的抑制作用，將靈菌紅素的產(chǎn)量提高了7.8倍，達(dá)583mg/L。</p><p>　　Wei等[17-18]以改進(jìn)LB培養(yǎng)基，提高胰蛋白胨和酵母膏的濃度并去除了NaCl發(fā)酵沙雷氏菌生產(chǎn)靈菌紅素，約比LB增產(chǎn)了3倍，達(dá)152mg/L；在培養(yǎng)基中添加 2%－6% 的植物油，如豆油、棕櫚油、葵花子油等可促進(jìn)靈菌紅素的合成，最高達(dá)790　mg/L，表明靈菌紅素合成與胞外生物表面活性劑

28、的存在有關(guān)。Cang 等從土壤中分離獲得一株沙雷菌 S389，以乙醇為唯一碳源，靈菌紅素產(chǎn)量最高可達(dá)2.95g/L。</p><p>　　Giri等[19]在黏質(zhì)沙雷菌的培養(yǎng)基中分別添加花生籽粉、芝麻粉、咖啡粉，不添加其他物質(zhì)，均能顯著增加靈菌紅素產(chǎn)量，其中以添加花生籽粉最為顯著，達(dá)到38.75g/L。</p><p>　　Helvia等[20]在沙雷氏菌的培養(yǎng)基中分別添加木薯廢水和甘露醇

29、，能顯著增加靈菌紅素的產(chǎn)量，并大大的降低了生產(chǎn)的成本，并且靈菌紅素的產(chǎn)量達(dá)到49.5 g/L。</p><p>　　1.4 實(shí)驗(yàn)的目的、內(nèi)容與難點(diǎn)</p><p>　　本課題所研究探討的是通過改變沙雷氏菌的培養(yǎng)條件，主要是碳源、氮源的替換來降低靈菌紅素的生產(chǎn)成本。其中使用的碳源、氮源均為廉價(jià)的農(nóng)業(yè)農(nóng)作物和工業(yè)廢棄物，在發(fā)酵靈菌紅素的過程中產(chǎn)量不穩(wěn)定，數(shù)據(jù)的變動(dòng)較大。其次，靈菌紅素是一種脂溶

30、性的物質(zhì)，易溶于發(fā)酵液中，不易完全提取。因此，如何找到合適的碳源、氮源，如何穩(wěn)定靈菌紅素的生產(chǎn)，有效的提取靈菌紅素的本試驗(yàn)的難點(diǎn)，加大了實(shí)驗(yàn)的工作強(qiáng)度。</p><p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)部分</b></p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p><b>　　2.1.1 菌種<

31、;/b></p><p>　　黏質(zhì)沙雷氏菌( Serratia jx.1)，本實(shí)驗(yàn)室保藏。</p><p>　　2.1.2 主要儀器與試劑</p><p>　　HD-930組合式全溫度震蕩培養(yǎng)箱 （大倉市博萊特實(shí)驗(yàn)儀器廠）；</p><p>　　VS-15000CFN II 型小型高速離心機(jī)（上海民儀電子有限公司）；</p>

32、;<p>　　VS-1300型潔凈工作臺（蘇州時(shí)速為凈化設(shè)備有限公司）；</p><p>　　PHS-3C型精密pH計(jì)（上海安亨昌吉149號雷磁儀器廠）；</p><p>　　AL-204型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；</p><p>　　752s 紫外可見分光光度計(jì) (上海棱光技術(shù)有限公司)；</p><p>

33、　　DSX-280A型不銹鋼手提式滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；</p><p>　　LRH-250A型生化培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠）。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)所用丙酮、氯化鈉、硫酸鎂、甘油、乙酸乙酯等均為分析純；PN5247蛋白胨、牛肉浸膏等均為生化試劑。</p><p>　　2.1.3 培養(yǎng)基</p><p>　　種子培養(yǎng)基 (g/

34、L)：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，瓊脂15，pH 7.4-7.6。</p><p>　　擴(kuò)大培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 13.0，甘油20.0 Nacl 5.0 搖瓶裝液量 20mL/250mL（V/V）pH自然。</p><p>　　發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨13.0, 甘油20.0, MgSO4 1.2, NaCl 5.0, Gly 2.0，搖瓶裝液量50 mL/2

35、50mL(V/V)，接種量5％(V/V)，pH 5.7。</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 種子的培養(yǎng)和優(yōu)化</p><p>　　種子培養(yǎng)基的配制：按照種子培養(yǎng)基的組成稱取牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，瓊脂15g，放到1000mL的燒杯中加水至1000mL，加熱攪拌

36、溶解，用1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，使其在7.4-7.6。然后分裝在250mL的搖瓶中，用滅菌鍋在121℃下滅菌20min，最后再倒平板。待平板冷卻后在無菌條件下，用接種針挑取甘油管中的菌種劃平板，放在生化培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)12h，即得到活化的沙雷氏菌，將其放于冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　2.2.2 種子的擴(kuò)大培養(yǎng)</p><p>　　分別稱

37、?。╣/L）蛋白胨13.0、甘油20.0、NaCl 5.0加入燒杯中加水，攪拌，使燒杯中的物料都溶解并分裝于250mL的搖瓶中，每個(gè)搖瓶裝50mL的培養(yǎng)基，并用滅菌鍋在121℃下高溫蒸汽滅菌20min，待搖瓶內(nèi)的培養(yǎng)基冷卻后在無菌條件下接種，用接種針挑取平板上的單菌落于搖瓶中。接種完后，液體培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為170r/min。</p><p>　　2.2.3 靈菌紅素的發(fā)酵培養(yǎng)</p&g

38、t;<p>　　把擴(kuò)大培養(yǎng)基中的種子接種于不同的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為2%。接種完后，液體培養(yǎng)55h，培養(yǎng)溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為170r/min。</p><p>　　2.2.3 紅色素與菌體的提取</p><p>　　轉(zhuǎn)接后放在搖床里培養(yǎng)55h后取出，搖勻，分別用移液槍移取1.00mL發(fā)酵液于1.5mL離心管中，4℃，12000r/min，離心10min。棄上清液，然后用移液

39、槍移取1mL的丙酮于各個(gè)離心管中，用100μL槍頭攪拌使色素完全溶于丙酮中，再離心，溫度為4℃，10000r/min，離心10min。得到靈菌紅素丙酮溶液。若上清液的顏色比較深，取0.5mL的上清液放入10mL的試管中，加入1mL的乙酸乙酯，加入食鹽，形成過飽和溶液，用鹽酸將其調(diào)至酸性，然后震蕩，將靈菌紅素萃取到乙酸乙酯相中。</p><p>　　2.2.4 靈菌紅素含量測定</p><p&

40、gt;　　本實(shí)驗(yàn)利用靈菌紅素在535nm波長下具有最大吸收峰的特性，將提取的靈菌紅素丙酮溶液或乙酸乙酯溶液稀釋10-100倍后于535nm波長下測量吸光度并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出發(fā)酵液中靈菌紅素含量。</p><p>　　2.2.5 單因子實(shí)驗(yàn)</p><p>　　實(shí)驗(yàn)選取不同的碳源、氮源進(jìn)行單因子實(shí)驗(yàn)，其中碳源分別為棉籽柏、菜柏、花生柏、玉米粉、玉米淀粉、小麥粉、山芋淀粉、玉米皮、花生油

41、、芝麻油、麩皮等，用其替代對照培養(yǎng)基中的甘油；氮源為小黃豆粉、黃豆粉、豆柏、豆奶粉、花生粉、豆蛋白粉等，用其代替對照培養(yǎng)基中的氮源，除此之外還有碳源氮源一起替換的為花生粉，芝麻粉，工業(yè)廢水等，進(jìn)行對照培養(yǎng)，選出對靈菌紅素生產(chǎn)影響較大的幾種因素，再把被選取的因素各制成不同濃度梯度的實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基。接種后置于28℃，170rpm搖床中培養(yǎng)55h，提取后測量吸光度并換算成濃度，比較各因子的顯著性，實(shí)驗(yàn)平行三次。</p><p

42、>　　碳源、氮源的原料初篩分別見表2-1，表2-2；單因素濃度設(shè)定見表2-3。</p><p>　　表2-1 碳源粗篩原料列表</p><p>　　表2-2 氮源初篩原料列表</p><p>　　表2-3單因素濃度梯度列表</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>

43、;　　紅色素作為一類具有重要生物活性的微生物次級代謝產(chǎn)物，在醫(yī)藥、紡織、食品等領(lǐng)域均具有巨大的應(yīng)用潛力，但現(xiàn)報(bào)道的紅色素的產(chǎn)量很低，影響了它進(jìn)一步的研究開發(fā)，本實(shí)驗(yàn)分別考察了不同的培養(yǎng)條件對紅色素的胞外積累量和對菌株生長的影響，以便確定最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)條件，獲得最高的紅色素的積累量，加快紅色素的工業(yè)化進(jìn)程。</p><p><b>　　3.1 單因素實(shí)驗(yàn)</b></p><

44、p>　　3.1.1 替代碳源初選實(shí)驗(yàn)</p><p>　　圖1 不同氮源對靈菌紅素產(chǎn)量的影響</p><p>　　其中編號分別為：1—-棉籽粕；2—-菜粕；3—-花生粕；4—-玉米粕；5—-玉米淀粉；6—-小麥粉；7—-山芋淀粉；8—-玉米皮；9—-花生油；10—-芝麻油；11—-麩皮。</p><p>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：花生油和芝麻油替代甘油作為碳源的所獲得

45、的靈菌紅素最多，其次是花生粕、小麥粉、山芋淀粉、玉米粕、玉米淀粉，而棉籽粕、菜粕、玉米皮、麩皮基本不生產(chǎn)靈菌紅素。因此，選取小麥粉、山芋淀粉、玉米粉、花生粕做濃度梯度實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　3.1.2 碳源濃度梯度實(shí)驗(yàn)</p><p>　　圖2 小麥粉對靈菌紅素產(chǎn)量的影響</p><p>　　圖3 山芋淀粉對靈菌紅素產(chǎn)量的影響</p><p

46、>　　圖4玉米粉對靈菌紅素產(chǎn)量的影響</p><p>　　圖5 花生粕對靈菌紅素產(chǎn)量的影響</p><p>　　根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)，處理數(shù)據(jù)得到：小麥粉的濃度為15g/L時(shí)所得的靈菌紅素吸光度最大，產(chǎn)量最高。其次是花生粕，山芋淀粉，玉米粉。其中花生粕的產(chǎn)量沒有呈一個(gè)大體的趨勢，分析原因，可能是：原料中花生粕的含量不均勻；發(fā)酵生產(chǎn)過程中靈菌紅素的在搖瓶上附著多，沒有完全融到發(fā)酵液中，使取樣困

47、難。</p><p>　　3.1.3 替代氮源初選實(shí)驗(yàn)</p><p>　　圖6 不同氮源替代對靈菌紅素的影響</p><p>　　其中編號分別為：1—-小黃豆粉；2—-黃豆粉；3—-豆粕；4—-豆奶粉；5—-豆蛋白粉。</p><p>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：小黃豆粉替代蛋白胨生產(chǎn)靈菌紅素產(chǎn)量最高，其次是豆粕，黃豆粉 豆奶粉，豆蛋白粉。因此選取小

48、黃豆粉做濃度梯度實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　3.1.4 氮源濃度梯度實(shí)驗(yàn)</p><p>　　根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)的參考，選取了6種因素做濃度梯度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下：</p><p>　　圖7 小黃豆粉對靈菌紅素產(chǎn)量的影響</p><p>　　圖8 純花生對靈菌紅素產(chǎn)量的影響</p><p>　　圖9 純芝麻粉對靈菌紅素

49、產(chǎn)量的影響</p><p>　　圖10 純小麥粉對靈菌紅素產(chǎn)量的影響</p><p>　　圖11 純小黃豆粉對靈菌紅素產(chǎn)量的影響</p><p>　　圖12 工業(yè)廢水對靈菌紅素產(chǎn)量的影響</p><p>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：20g/L純花生培養(yǎng)生產(chǎn)靈菌紅素所得的吸光度最大，說明相對的靈菌紅素的產(chǎn)量最大，其次是20g/L純芝麻粉、60g/L純小麥

50、粉、10g/L純小黃豆粉、10g/L小黃豆粉、50（mL/50mL）工業(yè)廢水。</p><p>　　為了方便對各因素進(jìn)行橫向和縱向的比較，我們使用甘油蛋白胨培養(yǎng)基為對照培養(yǎng)基，進(jìn)行比較，根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，使用2%純花生粉發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素，所得的靈菌紅素丙酮溶液和乙酸乙酯溶液的所測得的吸光度值最大。分別提取等體積的純花生發(fā)酵液和甘油蛋白胨發(fā)酵液中的靈菌紅素，稱量其干重均能達(dá)到5g/L。</p>&

51、lt;p>　　3.2 生產(chǎn)成本計(jì)算</p><p>　　甘油蛋白胨發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨13.0, 甘油20.0, MgSO4 1.2, NaCl 5.0, Gly 2.0。其每種原料的價(jià)格和配1L培養(yǎng)基的成本列表（表3-2-1）如下：</p><p><b>　　表3-2-1</b></p><p>　　純花生培養(yǎng)基(g/L)：花

52、生米20。其價(jià)格和配1L培養(yǎng)基的成本列表（表3-2-2）如下：</p><p><b>　　表3-2-2</b></p><p>　　現(xiàn)在花生粒的價(jià)格一般為7.5元/500g，因此配置1L的純花生培養(yǎng)基所需要的成本為0.3元。</p><p>　　實(shí)驗(yàn)室使用甘油蛋白胨培養(yǎng)基和純花生培養(yǎng)基生產(chǎn)靈菌紅素的產(chǎn)量基本上相同均為5 g/L，因此，使用甘油

53、蛋白胨配方生產(chǎn)靈菌紅素的生產(chǎn)成本為670元/Kg，純花生配方的為60元/Kg。靈菌紅素的成本降低了約91.1%，節(jié)約了生產(chǎn)成本，更利于工業(yè)化生產(chǎn)。</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　本研究課題主要是對產(chǎn)靈菌紅素的沙雷氏菌的培養(yǎng)條件的優(yōu)化，降低生產(chǎn)成本。實(shí)驗(yàn)首先選取了多種比價(jià)廉價(jià)及普遍的原料來替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源，進(jìn)行碳、氮源的

54、初篩實(shí)驗(yàn)；其次，根據(jù)碳氮、源的初篩實(shí)驗(yàn)，選取了小麥粉、山芋淀粉、玉米粉、花生粕和小黃豆粉5種原料做梯度實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明10 g/L濃度下的小黃豆粉培養(yǎng)基生產(chǎn)靈菌紅素最多。通過參考文獻(xiàn)，選取了純花生、純芝麻、純小麥粉、純小黃豆粉、工業(yè)廢水5種原料做梯度實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明使用20 g/L濃度下的純花生培養(yǎng)基生產(chǎn)靈菌紅素產(chǎn)量最大，其次是純芝麻粉。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選出一種相對靈菌紅素生產(chǎn)影響最大的配方，其配方為：2%花生粉，搖瓶裝液量50 m

55、L/250mL(V/V)，接種量2％(V/V)，培養(yǎng)溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速170r/min，培養(yǎng)55h。發(fā)酵生產(chǎn)的靈菌紅素產(chǎn)量稱干重約為5g/L，與實(shí)驗(yàn)室原來的最佳培養(yǎng)所發(fā)酵生產(chǎn)的色素差不多，但是卻大大的降低了91.1%的原料生產(chǎn)成本。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] Shieh W Y, Chen Y W, Chaw S M，

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