OsLIC1基因參與水稻株型調(diào)控的功能研究.pdf

1、CCCH型鋅指蛋白是進(jìn)化上比較保守的一類鋅指蛋白家族，其典型的氨基酸的基序?yàn)镃-X7-8-C-X5-C-X3-H，其中X為任意氨基酸，這類鋅指基序一般以重復(fù)的雙拷貝形式存在。本論文克隆并鑒定了一個(gè)全新的、只含有一個(gè)CCCH型鋅指基序的基因，利用反義RNA策略研究該基因功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因的反義轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出葉夾角增大的表型，因此我們將該基因命名為OsLIC1(Oryza sativa Lamina Increased Leaf Ang

2、le Control1)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因定位于水稻6號(hào)染色體近端粒的一端，位于BAC克隆AP004324中。OsLIC1與通常的CCCH型鋅指蛋白含有多個(gè)重復(fù)的CCCH鋅指基序不同，它只含有一個(gè)CCCH型鋅指基序。除了CCCH鋅指結(jié)構(gòu)域以外，該蛋白在靠近C-端的位置還有一段絲氨酸(Ser)富集的區(qū)域，在此區(qū)域之前，還有一個(gè)在真核生物中相對(duì)保守的，以EELR為核心基序的結(jié)構(gòu)域。采用基因槍將含OsLIC1-GFP融合構(gòu)建的瞬時(shí)表達(dá)

3、載體轟擊入洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)OsLIC1-GFP可以定位到細(xì)胞核中。利用酵母轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)以EELR為核心基序的結(jié)構(gòu)域具有轉(zhuǎn)錄激活的功能。體外核酸結(jié)合活性分析顯示OsLIC1蛋白可以結(jié)合雙鏈DNA，這些結(jié)果證明OsLIC1是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，這也是在植物中首次發(fā)現(xiàn)CCCH型鋅指蛋白可以作為轉(zhuǎn)錄因子的方式調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。
　　 用玉米泛素啟動(dòng)子(Maize Ubiquitin promoter)驅(qū)動(dòng)OsLIC1

4、基因的反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻，獲得的內(nèi)源OsLICI基因表達(dá)量下降的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出三個(gè)明顯的表型：轉(zhuǎn)基因植株的葉夾角增大；轉(zhuǎn)基因的株高低于對(duì)照以及轉(zhuǎn)基因植株的穗粒數(shù)減少。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株葉夾角增大是由于近軸面細(xì)胞排列發(fā)生了改變以及維管束發(fā)育受阻引起的。轉(zhuǎn)基因植株的Southern Blot和RT-PCR分析，結(jié)合Western Blot分析證明了轉(zhuǎn)基因植株的表型與轉(zhuǎn)基因事件之間的直接聯(lián)系，并證明了轉(zhuǎn)基因植株中內(nèi)源OsLIC1在

5、蛋白水平的確受到了抑制。采用RT-PCR技術(shù)、Promoter::GUS和RNA in situ雜交三種方法相結(jié)合研究OsLIC1基因的表達(dá)模式，結(jié)果表明OsLIC1基因主要在葉頸、節(jié)以及分蘗原基中表達(dá)，這與轉(zhuǎn)基因植株的表型相吻合，進(jìn)一步證明了轉(zhuǎn)基因植株的表型與基因功能之間的關(guān)系。Affymetrix水稻全基因組芯片分析結(jié)果顯示許多受油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)表達(dá)的基因在轉(zhuǎn)基因植株的葉頸材料中表達(dá)量上調(diào)，RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果。由于在轉(zhuǎn)基

6、因植株中出現(xiàn)的葉夾角增大的表型和水稻油菜素內(nèi)酯的作用相似，而基因芯片的結(jié)果又從分子水平提供了證據(jù)和線索。進(jìn)一步采用RT-PCR和Promoter∷GUS相結(jié)合的方法研究OsLIC1基因?qū)τ筒怂貎?nèi)酯的響應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsLIC1基因可以被油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)表達(dá)。而且，OsLIC1基因的反義轉(zhuǎn)基因植株與野生型相比，表現(xiàn)出對(duì)油菜素內(nèi)酯信號(hào)更敏感的響應(yīng)。根據(jù)以上結(jié)果，推測(cè)OsLIC1可能是水稻油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)控因子。水稻油菜素內(nèi)酯合成和信

7、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的突變體d2-1和d61-1具有直立的葉片的特征。用反義OsLIC1轉(zhuǎn)基因植株以及野生型水稻與d2-1和d61-1突變體分別進(jìn)行遺傳雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在反義OsLIC1轉(zhuǎn)基因植株與d2-1和d61-1突變體的雜交F1代中，都表現(xiàn)出葉夾角增大的表型。但是，在F2代中，在d2-1和d61-1純合背景下，分別表現(xiàn)出葉夾角增大和葉片直立的表型，說(shuō)明OsLIC1上位于d2-1，而d61-1則上位于OsLIC1。這一結(jié)果進(jìn)一步證明了OsLIC1是