抗菌蛋白、硫堇蛋白等辣椒PR基因轉(zhuǎn)化水稻及其抗稻瘟病初步分析.pdf

1、水稻作為我國最主要的糧食作物之一，是我國糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要戰(zhàn)略資源。長期以來，稻瘟病、紋枯病、白葉枯病等真菌性或者細菌性病害嚴重限制了水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。通過基因工程克隆抗病基因并與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合培育抗病新品種是現(xiàn)代作物遺傳改良的有效途徑。本研究擬從辣椒中分離出的廣譜抗病基因(抗菌蛋白、硫素蛋白、親環(huán)蛋白、鐵氧還蛋白、非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白)與強誘導(dǎo)型啟動子LLJRP1(Late Upregulated in Response

2、 toHyaloperonospora parasitica)結(jié)合起來轉(zhuǎn)化水稻日本晴，獲得轉(zhuǎn)基因植株，并進行稻瘟病的初步抗性分析，從中篩選具有較強抗稻瘟病的轉(zhuǎn)基因新品種，為實現(xiàn)水稻抗病與高產(chǎn)的有機統(tǒng)一打下一定的基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下：
　　 1、利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建了CaAPs(抗菌蛋白)、CaThs(硫堇蛋白)、CaCyPs(親環(huán)蛋白)，CaFds(鐵氧還蛋白)、CansLTPs(非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白)的植物表達載體，并進

3、行測序驗證，結(jié)果表明上述5個辣椒PRs基因已成功構(gòu)建到pMDC—32植物表達載體中，且目標基因序列與原序列完全一致；
　　 2、以日本晴成熟種子為材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法，將上述5個辣椒PRs基因轉(zhuǎn)化粳稻品種日本晴中，并初步統(tǒng)計其轉(zhuǎn)化率以及陽性率。結(jié)果表明，成熟日本晴種子的愈傷誘導(dǎo)率大約在80％—90％之間，轉(zhuǎn)化率大約在9％—15％，其中CaAPs篩選開始時的愈傷數(shù)約為263個，分化苗數(shù)為31株，轉(zhuǎn)化率約11．79

4、％；CaThs篩選開始時的愈傷數(shù)約為235個，分化苗數(shù)為25株，轉(zhuǎn)化率約為10．64％；CaCyPs篩選開始時的愈傷數(shù)約為187個，分化苗數(shù)為17株，轉(zhuǎn)化率約為9．09％；CaFds篩選開始時的愈傷數(shù)約為206個，分化苗數(shù)為23株，轉(zhuǎn)化率約為11．17％；CansLTPs篩選開始時的愈傷數(shù)約為157個，分化苗數(shù)為17株，轉(zhuǎn)化率約為10．83％。提取水稻基因組DNA，進行PCR驗證，計算轉(zhuǎn)基因水稻的陽性率，其中，獲得CaAPs陽性植株30

5、株，陽性率約為96．77％；獲得CaThs陽性植株株25株，陽性率約為100％，獲得CaCyPs陽性植株17株，陽性率約為100％，獲得CaFds陽性植株23株，陽性率約為100％；獲得CansLTPs陽性植株15株，陽性率約為88．24％。由于栽培管理以及病菌侵染等因素，部分轉(zhuǎn)基因苗死亡。最后，將28株CaAPs陽性植株，23株CaThs陽性植株，15株CaCyPs陽性植株，20株CaFds陽性植株，15株CansLTPs陽性植株移栽

6、大田，收獲T1代種子；
　　 3、對上述T1代轉(zhuǎn)基因植株進行稻瘟菌guy1的接種處理，通過RT—PCR分析上述CaAPs，CaThs，CansLTPs基因在水稻中的表達情況，并進行轉(zhuǎn)基因植株的表型分析及抗性鑒定。RT—PCR結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，外源抗CaAPs，CaThs，CansLTPs基因在稻瘟菌未接種和接種的條件下，都有不同程度的表達，但在接種后表達量都有所提高。與接種稻瘟菌的野生型日本晴植株相比，外源CaAPs，CaThs，C

7、ansLTPs基因這三個轉(zhuǎn)基因水稻的發(fā)病程度明顯較輕，表明對稻瘟病的抗性有不同程度的提高。這些結(jié)果表明，辣椒外源防衛(wèi)反應(yīng)基因轉(zhuǎn)化水稻日本晴在一定程度上提高了水稻對稻瘟菌的抗病性，此外。又進一步驗證了前人的研究結(jié)果：不同高等植物里含有一套相似的防衛(wèi)反應(yīng)基因。
　　 4、擬南芥LURP1啟動子在水稻中的表達分析發(fā)現(xiàn)，在雙子葉模式植物擬南薺抗病中起重要調(diào)節(jié)作用的LURP1啟動子同樣可以在水稻中誘導(dǎo)抗性基因的表達，這說明單子葉和雙子葉植