水稻Pi21基因RNAi植株的抗稻瘟病研究及轉(zhuǎn)mCherry基因水稻的遺傳分析.pdf

1、稻瘟病是由子囊菌Magnaporthe grisea引起的廣泛發(fā)生在世界各稻區(qū)的最重要水稻病害之一，也是限制水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要因素。目前，培育和利用抗病品種是經(jīng)濟、安全而且有效的措施。然而，稻瘟病是一種典型的寄主-病原菌共演化系統(tǒng)，其致病性變異和分化的結(jié)果往往造成垂直抗性的品種難以維持其抗病的持久性。因此，培育持久抗病品種成為目前水稻生產(chǎn)上的迫切要求。
　　 pi21屬于隱性遺傳和數(shù)量性狀抗病性，是第一個被定位的廣譜持久抗稻瘟病

2、基因。本研究以Pi21基因3'端非編碼區(qū)、終止子下游第17個堿基開始的275個堿基片段用于Pi21干涉載體的構(gòu)建(pLYL21)。將pLYL21載體轉(zhuǎn)化到水稻日本晴胚性愈傷中，以sGFP作為報告基因獲得了93個獨立轉(zhuǎn)化植株。對T0和T1代干涉株系進行Pi21的半定量RT-PCR分析，結(jié)果表明相對于對照未轉(zhuǎn)化日本晴，干涉株系中Pi21的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，且對稻瘟病表現(xiàn)抗性。接種稻瘟菌后分時段取樣，對抗病相關(guān)基因進行半定量RT-PCR，結(jié)果

3、顯示，對照日本晴植株中OsWRKY28、ABCtransporter-1和ABC transporter-2在12h后誘導(dǎo)表達，表達量增高，但在Pi21干涉株系中的表達量明顯降低，在干涉株系和未轉(zhuǎn)化日本晴中，PR1、PAL和OsWRKY45基因在接種48h后得到誘導(dǎo)表達。另外，為了建立稻瘟菌與Pi21-RNAi植株之間的可視化互作系統(tǒng)，本研究還通過PEG介導(dǎo)的方法將紅色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化到稻瘟菌菌株E2007-046A2中，并獲得了穩(wěn)定的

4、轉(zhuǎn)化子，為后續(xù)的實驗提供材料。
　　 為了建立轉(zhuǎn)基因水稻的高通量遺傳分析系統(tǒng)，本研究還以粳稻成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織為受體材料，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)為抗性篩選標(biāo)記，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將紅色熒光蛋白基因mCherry導(dǎo)入水稻。在水稻轉(zhuǎn)化愈傷組織、轉(zhuǎn)化植株(T0)和轉(zhuǎn)基因后代(T1)均檢測到紅色熒光，證實mCherry在轉(zhuǎn)基因水稻中穩(wěn)定表達。139個獨立轉(zhuǎn)化株系的遺傳分析表明，mCherry在轉(zhuǎn)基因后代表現(xiàn)多種遺傳模式，54％的

5、轉(zhuǎn)基因株系呈單位點遺傳。TAIL-PCR進一步驗證轉(zhuǎn)基因整合到水稻基因組。根據(jù)T-DNA整合位點DNA序列分析結(jié)果，T-DNA左邊界發(fā)生堿基缺失、增加和替換，右邊界只發(fā)生堿基缺失，說明左邊界比右邊界有更多的堿基變異類型。此外，對T2代植株mCherry和HPT的轉(zhuǎn)錄水平進行實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR分析，結(jié)果表明，mCherry和HPT轉(zhuǎn)錄水平因T-DNA在水稻基因組中的整合位置而變化，表現(xiàn)位置效應(yīng)。本研究在mCherry熒光蛋白和其它相關(guān)方