海洋生物污損過程的分子標(biāo)記技術(shù)研究.pdf

1、附著在船底、輸水管道等人工設(shè)施表面的海洋生物，給海洋業(yè)的發(fā)展造成巨大的損失。海洋防污成為亟待解決的重要問題，防止污損的發(fā)生應(yīng)從海洋生物附著早期入手，所以對污損生物早期附著過程的研究是防污損技術(shù)開發(fā)的重要基礎(chǔ)。而目前關(guān)于污損生物的研究大多集中于污損生物生態(tài)學(xué)和防污技術(shù)方面，對于污損動力過程的研究相對較少，尤其是分子生物學(xué)層面。所以本課題致力于利用分子標(biāo)記技術(shù)來探究污損過程：
　　一方面，考察不同海洋工程涂層表面附著的海洋污損原核微生

2、物特異性基因表達與不同種類防污涂層表面可能的對應(yīng)關(guān)系。通過查閱相關(guān)書籍文獻，收集了78種不同的海洋污損生物名單，繼而在EBI數(shù)據(jù)庫中檢索并確定含有全基因組序列的海洋污損微生物名稱，然后通過由哈佛大學(xué)生物統(tǒng)計學(xué)實驗室構(gòu)建全基因組特異性基因數(shù)據(jù)庫查閱它們的屬特異性和種特異性基因，最后得到21個屬的特異性基因和10個種的特異性基因。根據(jù)引物設(shè)計原則，對每個種、屬的特異性基因逐一條設(shè)計及驗證，直到得到合適的引物對，共31對引物組合（其中21對針

3、對屬特異性基因）。
　　通過長達一年的實海掛板實驗篩選出6種促進和5種抑制牡蠣生長的不同納米材料涂層，這些納米材料分別是硅納米粉末、納米碳粉、石墨粉末、碳納米粉末。通過短期掛板實驗（15天）收集不同時期的污損早期樣品。用31對特異性引物掃描污損早期樣品混合基因組DNA，成功確定6對不同屬特異性引物包括不動桿菌屬（Acinetobacter）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、超微細菌屬（Glaciecola）、簡納西氏菌屬

4、（Jannaschia）、紅球菌屬（Rhodococcus）和亞硫酸鹽桿菌屬（Sulfitobacter）。應(yīng)用已經(jīng)確定的6對屬特異性引物掃描不同材料表面、不同時期樣品基因組DNA，結(jié)果表明，簡納西氏菌屬（Jannaschia）、紅球菌屬（Rhodococcus）和亞硫酸鹽桿菌屬（Sulfitobacter）等在兩類樣品中表達存在一定差異，其中簡納西氏菌屬（Jannaschia）差異尤為顯著，不動桿菌屬（Acinetobacter）只出

5、現(xiàn)在含有納米材料MWNT（<8nm）的涂層表面。
　　另一方面，初步嘗試克隆海洋污損真核生物早期高表達的基因（約14天，在15℃）。主要克隆的策略是：通過采用試劑盒提供的含酶切位點的接頭引物與cDNA連接，用多種限制酶及其組合（HindIII、BamHI、PstI、XbaI等）對cDNA進行酶切，然后在相同的限制性位點連接入載體。目前已克隆超過300個白色菌落，純化并進行DNA測序。從測序的實驗結(jié)果表明，海洋真核污損生物cDNA全