利用RNA瞬時干擾技術(shù)研究甘油二酯激酶基因在水稻響應(yīng)激發(fā)子木聚糖酶和鹽處理中的作用.pdf

1、磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)/甘油二酯激酶(Diacylglycerol kinase，DGKs)介導的信號途徑是磷酸肌醇信號途徑中的重要組成部分。DGK家族是PLC/DGK途徑中的關(guān)鍵酶類，它能夠迅速磷酸化甘油二酯(Diacylglycerol，DAG)生成磷脂酸(Phosphatidic acid，PA)。DAG和PA都是植物細胞內(nèi)重要的信號分子，DGK對維持細胞內(nèi)DAG和PA的動態(tài)平衡具有重要作用。因此，DG

2、K基因可能在植物的生長發(fā)育，逆境與激素反應(yīng)以及抗病反應(yīng)等信號轉(zhuǎn)導途徑中起著關(guān)鍵的作用。而目前在水稻中關(guān)于水稻甘油二酯激酶基因家族(OsDGKs)的研究是相對欠缺的。另一方面，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在植物對抗生物以及非生物脅迫方面發(fā)揮重要作用，水稻轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY71更是被證明參與水稻的防御逆境應(yīng)答反應(yīng)。
　　 鑒于上述研究背景，在本文中，為了明確OsDGKs基因家族在水稻抗逆境信號轉(zhuǎn)導中的作用，我們分析研究了OsD

3、GKs家族基因在生物脅迫(木聚糖酶處理)和非生物脅迫(鹽處理)下的不同表達模式，通過半定量PCR和熒光定量PCR檢測OsDGKs家族基因在以上兩種逆境脅迫下的表達水平。研究發(fā)現(xiàn)：不同的OsDGK基因?qū)Σ煌拿{迫刺激呈現(xiàn)不同的應(yīng)答模式，OsDGK1基因在木聚糖酶處理下在6小時內(nèi)被快速激活，并保持長時間的高水平表達，該基因在鹽脅迫下也在一定程度上被激活；OsDGK2，OsDGK3基因在兩種脅迫下表現(xiàn)出不同的被誘導表達模式，但誘導表達水平較O

4、sDGK1低；OsDGK7基因本底表達豐度始終較高，而且在兩種脅迫處理下沒有表現(xiàn)出明顯的誘導表達趨勢。研究結(jié)果初步表明：OsDGKs家族部分基因能在木聚糖酶處理和鹽脅迫環(huán)境下被誘導表達，參與了水稻抗逆境脅迫信號轉(zhuǎn)導途徑，尤其是參與了木聚糖酶誘導的抗病防衛(wèi)反應(yīng)。
　　 為研究水稻OsDGKs基因家族和水稻轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY71在抗逆境信號轉(zhuǎn)導途徑中的關(guān)系，我們建立了一個以水稻幼苗原生質(zhì)體為實驗材料，用于快速研究基因功能和基因之間

5、相互作用的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)瞬時干擾體系。研究發(fā)現(xiàn)：在體外轉(zhuǎn)錄合成以O(shè)sWRKY71編碼區(qū)基因片段為模板的dsRNA，用合成的dsRNA轉(zhuǎn)染水稻原生質(zhì)體，再用木聚糖酶處理轉(zhuǎn)染24小時后的原生質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)本在木聚糖酶誘導下能被激活表達的OsDGKs家族基因的表達量均有明顯的下降；而用體外轉(zhuǎn)錄合成的以O(shè)sDGKs保守區(qū)基因片段為模板的dsRNA轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體后，亦用木聚糖酶處理轉(zhuǎn)染24小時后的原生質(zhì)

6、體，發(fā)現(xiàn)同樣能被木聚糖酶激活表達的OsWRKY71基因的表達量也顯著下降。而在用NaCl處理上述轉(zhuǎn)染后原生質(zhì)體的實驗中，OsDGKs和OsWRKY71的基因表達量均與對照沒有明顯差異。另外，在水稻遭受病害脅迫和鹽脅迫時，水稻脅迫相關(guān)基因OsNPR1、OsCIPK15均能被誘導表達，實驗中，該類基因在OsDGKs多基因同時被沉默后的水稻原生質(zhì)體中表達量較對照亦明顯下降。根據(jù)上述實驗結(jié)果推測表明：在木聚糖酶介導的水稻抗病反應(yīng)中，OsDGKs

7、與OsWRKY71之間可能存在相互調(diào)控關(guān)系；而在水稻抗鹽反應(yīng)信號途徑中，OsDGKs與OsWRKY71可能不存在相互作用；并推測水稻OsDGKs家族基因在以上兩種逆境脅迫下通過直接或者間接的方式調(diào)節(jié)脅迫相關(guān)基因OsNPR1、OsCIPK15的表達來參與逆境脅迫信號的傳導途徑；OsWRKY71基因可能與OsDGKs協(xié)同參與了水稻抗病反應(yīng)，但不參與水稻的鹽脅迫反應(yīng)應(yīng)答途徑。
　　 在本文中，我們利用RNA瞬時干擾技術(shù)特異性干擾OsW

8、RKY71基因和OsDGKs基因家族部分成員，鹽處理干擾后原生質(zhì)體細胞6小時，然后用FDA標記原生質(zhì)體細胞活力，從而探討了不同基因在鹽脅迫誘導的水稻原生質(zhì)體細胞活力下降乃至細胞死亡中的作用。
　　 我們優(yōu)化了水稻幼苗葉、莖、根原生質(zhì)體的分離和轉(zhuǎn)染的方法，水稻原生質(zhì)體基因瞬時干擾的方法。探索了對OsDGKs基因家族的單個基因特異性沉默和多基因同時沉默的方法，提高了瞬時干擾的效率，延長了瞬時干擾可持續(xù)作用的時間。
　　 本研