豬腸道硬壁菌門和擬桿菌門數(shù)量的檢測(cè)及其相對(duì)豐度與脂肪沉積的相關(guān)性研究.pdf

1、硬壁菌門（Firmicutes division，F(xiàn)D）和擬桿菌門（Bacteroidetes division，BD）是哺乳動(dòng)物腸道中的主要細(xì)菌，它們的相對(duì)豐度與人和鼠機(jī)體脂肪含量相關(guān)。本研究在成功建立檢測(cè)腸道擬桿菌門和硬壁菌門16S rRNA基因的實(shí)時(shí)定量PCR方法的基礎(chǔ)上，研究了豬腸道硬壁菌門、擬桿菌門、擬桿菌屬（Bacteroides spp．，BS）的豐度及硬壁菌門/擬桿菌門（FD/BD）和硬壁菌門/擬桿菌屬（FD/BS）比例

2、與脂肪沉積的關(guān)系。研究包括以下五個(gè)部分： 試驗(yàn)一建立定量PCR檢測(cè)腸道硬壁菌門和擬桿菌門16S rRNA基因的方法 通過對(duì)豬腸道中200多個(gè)菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，找到硬壁菌門和擬桿菌門16S rRNA各自保守又特異的堿基位點(diǎn)，并針對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)。再用8種代表細(xì)菌作常規(guī)和定量PCR以檢驗(yàn)這些引物的特異性，并用標(biāo)準(zhǔn)品等梯度稀釋以檢驗(yàn)這兩個(gè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系的定量情況。結(jié)果表明這兩對(duì)引物能夠

3、特異地檢測(cè)目的細(xì)菌，并得到預(yù)期長(zhǎng)度的產(chǎn)物，熔解曲線分析也表明為特異性擴(kuò)增；標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增的Ct值與目標(biāo)細(xì)菌DNA的拷貝數(shù)間呈線性相關(guān)。這些表明這兩個(gè)體系能夠特異地對(duì)硬壁菌門和擬桿菌門菌群作定量的檢測(cè)。 試驗(yàn)二肥胖和瘦的版納微型近交系豬腸道硬壁菌門、擬桿菌門及擬桿菌屬的差異 運(yùn)用定量PCR技術(shù)對(duì)胖的和瘦的云南版納微型近交系豬糞便中的硬壁菌門、擬桿菌門、擬桿菌屬及總細(xì)菌16S rRNA基因的拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算各類細(xì)菌占總細(xì)菌

4、的比例（相對(duì)豐度），以研究豬腸道微生物與脂肪沉積的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果表明胖豬的擬桿菌門豐度比瘦豬低～68％（P<0．001），而擬桿菌屬豐度也低～65％（P<0．001）；擬桿菌屬和擬桿菌門在胖豬和瘦豬中數(shù)量變化趨勢(shì)一致，擬桿菌屬在一定程度上可代表擬桿菌門，且都與體重呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0．01）；胖豬的硬壁菌門豐度略高于瘦豬，但差異不顯著，而FD/BD和FD/BS顯著高于瘦豬（P<0．05），且FD/BS與豬體重呈正的線性關(guān)系（P<0

5、．05）。 試驗(yàn)三梅山和長(zhǎng)白豬腸道硬壁菌門、擬桿菌門和擬桿菌屬豐度與脂肪沉積的相關(guān)關(guān)系 為在商用品種豬上進(jìn)一步驗(yàn)證豬腸道微生物與脂肪沉積的相關(guān)關(guān)系，本試驗(yàn)選40kg左右的脂用型梅山豬和瘦肉型長(zhǎng)白豬飼喂同一日糧。體重達(dá)90 kg時(shí)每品種選6頭進(jìn)行屠宰，測(cè)定背膘厚度和脂肪細(xì)胞直徑，并取盲腸內(nèi)容物以測(cè)定硬壁菌門、擬桿菌門、擬桿菌屬的拷貝數(shù)和豐度。結(jié)果表明梅山豬的背膘厚度比長(zhǎng)白豬高48％（P<0．001），脂肪細(xì)胞直徑和面積也顯

6、著大于長(zhǎng)白豬；長(zhǎng)白豬盲腸內(nèi)容物中有更高的總細(xì)菌、硬壁菌門、擬桿菌門及屬拷貝數(shù)（P<0．05）；梅山豬有低的擬桿菌門（P<0．01）和擬桿菌屬（P=0．013）豐度，硬壁菌門的豐度也略高于長(zhǎng)白豬（P=0．290），但差異沒有達(dá)到顯著；且梅山豬腸道菌群中FD/BD（P=0．055）和FD/BS（P<0．05）較長(zhǎng)白豬高，F(xiàn)D/BD和FD/BS與背膘厚度呈正相關(guān)（P<0．05）；擬桿菌門和屬的數(shù)量趨勢(shì)也一致，并且梅山豬的擬桿菌屬占擬桿菌門的比

7、例低于長(zhǎng)白豬（P=0．089），它們的豐度都與豬的背膘厚度呈負(fù)相關(guān)（P<0．05）。這些結(jié)果證明了梅山豬的確是脂肪型，而長(zhǎng)白豬為瘦肉型；并再次證實(shí)豬的體脂沉積與腸道擬桿菌門及屬的相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)，與FD/BD和FD/BS呈正相關(guān)。 試驗(yàn)四脂肪型和瘦肉型豬在不同日齡腸道的硬壁菌門、擬桿菌門和擬桿菌屬的變化 為了研究豬脂肪沉積的動(dòng)態(tài)變化對(duì)腸道菌群的影響，考察了3、4、5、7月齡梅山（脂肪）和DLY（瘦型）豬糞便中的總細(xì)菌、硬

8、壁菌門、擬桿菌門和擬桿菌屬數(shù)量情況。結(jié)果表明，梅山豬硬壁菌門豐度在各階段都略比DLY豬高，其中五月齡時(shí)達(dá)到顯著水平；隨著月齡增加兩種豬擬桿菌屬的數(shù)量逐漸下降（P<0．05）；隨月齡的增加，豬硬壁菌門豐度都逐漸增加（梅山P<0．05，DLY P<0．01），擬桿菌門豐度也有逐漸下降的趨勢(shì)（梅山P=0．104，DLY P<0．05），擬桿菌屬的豐度在兩個(gè)品種中都顯著或極限著地下降，F(xiàn)D/BD（梅山P=0．101，DLY P<0．01）和FD

9、/BS（P<0．01）也逐漸增加。這表明隨月齡增加腸道菌群的變化是與脂肪沉積增加相適應(yīng)的。而擬桿菌屬豐度隨脂肪沉積增加而下降幅度高于擬桿菌門，這說明擬桿菌屬是一個(gè)很好的脂肪沉積生物標(biāo)識(shí)。 試驗(yàn)五日糧碳水化合物和蛋白質(zhì)比例對(duì)豬脂肪沉積、腸道微生物及相關(guān)基因表達(dá)的影響 為了進(jìn)一步研究動(dòng)態(tài)的脂肪沉積與腸道微生物的關(guān)系，采用不同碳水化合物/蛋白質(zhì)（CHO/CP）日糧飼喂相同日齡的脂肪型和瘦肉型豬，考察皮下脂肪、肌內(nèi)脂肪、腸道菌群

10、及脂肪沉積相關(guān)基因表達(dá)的情況。選5月齡梅山豬和DLY豬各12頭，將其分別分成兩組（處理），一組飼喂高碳水化合物/蛋白質(zhì)（簡(jiǎn)稱高CHO，CP：10．1-11．2％）日糧，一組飼喂低碳水化合物/蛋白質(zhì)（簡(jiǎn)稱低CHO，CP：22．7％）日糧，試驗(yàn)期為3個(gè)月。試驗(yàn)開始、兩個(gè)月時(shí)測(cè)定活體背膘和糞便菌群，試驗(yàn)結(jié)束后每組選5頭試豬屠宰，測(cè)定背膘厚度、板油重、肌內(nèi)脂肪含量、盲腸內(nèi)容物的菌群、回腸ANGPTL4（angiopoietin-like pro

11、tein4）、脂肪和肌肉中PPARγ（peroxisome proliferator-activated receptorsγ）和H-FABP（heart-type fatty acid binding proteins）基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，高CHO增加了脂肪沉積（P<0．05），其中DLY豬肌內(nèi)脂肪含量增加尤為顯著（P<0．01），并提高了DLY豬肌肉組織中的PPARγ（P=0．093）和H-FABP（P=0．095）表達(dá)。在試

12、驗(yàn)開始時(shí)，梅山豬的硬壁菌門比例顯著高于DLY豬（P<0．05），并有較高FD/BD（P=0．127）和FD/BS（P=0．129）。兩個(gè)月時(shí)，梅山豬的硬壁菌門比例仍有較高的趨勢(shì)（P=0．106），F(xiàn)D/BS顯著高于DLY豬（P<0．05）；高CHO日糧提高了硬壁菌門比例（P=0．076）和FD/BS（P<0．01），降低了擬桿菌屬在總細(xì)菌（P=0．094）和擬桿菌門（P<0．05）中的比例。而三個(gè)月后各細(xì)菌占總細(xì)菌的比例差異均不顯著。這

13、表明改變?nèi)占Z碳水化合物/蛋白質(zhì)影響了豬的脂肪沉積及相關(guān)基因的表達(dá)和腸道微生物的組成，且腸道微生物的變化與脂肪沉積相適應(yīng)。 綜上所述，本研究結(jié)果表明： 1）建立的檢測(cè)豬腸道擬桿菌門和硬壁菌門16S rRNA基因的定量PCR方法能特異地對(duì)目的細(xì)菌作定量檢測(cè)； 2）豬腸道擬桿菌門和硬壁菌門的豐度與脂肪沉積存在相關(guān)關(guān)系，綜合表現(xiàn)為脂肪沉積高的硬壁菌門/擬桿菌門較高； 3）擬桿菌屬可代表擬桿菌門也與豬脂肪沉積呈負(fù)相