雙酰基肼類化合物初篩選系統(tǒng)的建立.pdf

1、昆蟲的蛻皮和變態(tài)受蛻皮激素和保幼激素的嚴格控制。蛻皮激素通過與蛻皮激素受體(EcR)和超氣門蛋白(USP)形成的異源二聚體相互作用，起動包括轉錄因子表達在內(nèi)的級聯(lián)反應，從而引起昆蟲的蛻皮和變態(tài)。雙酰基肼類殺蟲劑模擬昆蟲蛻皮激素功能，與蛻皮激素受體蛋白互相作用且難于分離，阻礙相關基因的表達，影響多種酶的活性，從而持續(xù)誘導蛻皮反應使蟲體早熟蛻皮而死亡。多種昆蟲蛻皮激素受體和超氣門蛋白基因的成功克隆為建立基于昆蟲蛻皮激素受體的雙?；骂悮⑾x劑

2、高通量篩選技術奠定了基礎。在細菌、酵母、昆蟲細胞系中表達的EcR和USP蛋白，無論其粗提液，還是純化蛋白，均可用于活性篩選。
　　 本研究克隆了斜紋夜蛾(鱗翅目)EcR和USP功能域基因，灰飛虱(同翅目)EcRcDNA全長，采用原核表達技術獲取純化蛋白，建立雙?；骂悮⑾x劑(先導化合物)的初篩選模型。研究結果如下：
　　 1.利用RT-PCR技術分別獲得了長度為1149bp的EcR目的片段和1062bp的USP的目的片段

3、，目的片段包含EcR、USP結構域中的C域(DNA結合域DNA-bindingdomain，DBD)、D域(鉸鏈域hingeregion)、E域(配體結合域ligand-binddomain，LBD)，經(jīng)氨基酸多重序列比對證明目的片段與鱗翅目的其它昆蟲有非常高的同源性。成功構建原核表達載體pEHISEGFPTEV-EcRcde和pEHISEGFPTEV-USPcde，表達載體經(jīng)誘導純化獲得EcR、USP功能域蛋白。目的蛋白以包涵體形式分

4、泌，分子量約為67kD和64kD與理論大小相符。
　　 2.應用自主優(yōu)化的RACE技術，克隆了灰飛虱的EcR基因全長cDNA序列(GenBank序列號為JQ031549)，全長3403bp，編碼閱讀框1521bp，編碼506個氨基酸；成為NCBI基因庫中第一個同翅目害蟲EcR全長序列，構建灰飛虱EcR基因原核表達載體pEHISEGFPTEV-EcRcde-H。實驗選取鱗翅目、鞘翅目、雙翅目的7種昆蟲的EcR基因的E域進行氨基酸比