Development and Validation of Antigen Capture Elisa for Detection of Group-a Porcine Rotavirus.pdf

1、輪狀病毒，屬于呼腸孤病毒科，是一種能夠引起嬰兒和大量新生動(dòng)物脫水性腹瀉和高死亡率的人畜共患病毒。其中，A群輪狀病毒感染常見(jiàn)于地方性和廣泛流行的病例中，可以導(dǎo)致斷奶前后仔豬的大量經(jīng)濟(jì)損失，主要表現(xiàn)為體重減輕、高發(fā)病率和死亡率。據(jù)報(bào)道，輪狀病毒可以通過(guò)種間傳播，并造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。本研究的目的是建立一種快速、高敏感性和特異性的ELISA方法檢測(cè)豬輪狀病毒，隨后開(kāi)展了流行毒株基因型的調(diào)查。
　　1.豬輪狀病毒VP6基因的克隆表達(dá)<

2、br>　　輪狀病毒的基因組由11個(gè)節(jié)段雙鏈RNA組成，三層結(jié)構(gòu)，非囊膜，病毒粒子直徑為100nm?；蚪M的第6節(jié)段編碼中間的衣殼蛋白VP6，VP6基因在哺乳動(dòng)物的A群輪狀病毒中具有高度同源性（約87-92％）;因此，其在A群輪狀病毒的診斷中具有重要意義。通過(guò)PCR的方法從我國(guó)豬A群輪狀病毒TM-a株中克隆VP6基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-KG-VP6，并將其導(dǎo)入原核表達(dá)菌株JM105中，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，純化后的重組蛋白約為70kD

3、a，最后利用該重組蛋白免疫小鼠以及實(shí)驗(yàn)兔，分別制備單克隆和多克隆抗體。
　　2.AC-ELISA方法的建立
　　(1)多克隆抗體的制備
　　用弗氏完全佐劑乳化的100μg VP6蛋白免疫四周齡BALB/c小鼠，之后每隔兩周，用相同劑量的弗氏不完全佐劑乳化的VP6蛋白加強(qiáng)免疫3次。在細(xì)胞融合試驗(yàn)前3天腹腔注射相同劑量的VP6蛋白。選擇高抗體滴度的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合試驗(yàn)。從小鼠脾臟中分離脾細(xì)胞，并將其與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融

4、合（比例為5∶1），獲得雜交瘤細(xì)胞。利用間接ELISA，western-blot和間接免疫熒光試驗(yàn)篩選抗VP6和豬A群輪狀病毒的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。用間接ELISA的方法篩選到了兩株對(duì)VP6蛋白和豬A群輪狀病毒均有強(qiáng)反應(yīng)原性的雜交瘤細(xì)胞，而且能夠分泌單克隆抗體Mab1A7(IgG1)和3F5(IgG2a)。其中，3F5抗體滴度(1∶25600)是1A7抗體滴度(1∶12800)的兩倍。將雜交瘤細(xì)胞通過(guò)腹腔注射的方式注入BALB/c小鼠體內(nèi)，

5、10天之后，收集腹腔液，用飽和的硫酸銨溶液純化IgG，再用透析和親和柱層析的方法純化該蛋白，最后，用western blot和間接免疫熒光方法進(jìn)一步證實(shí)其反應(yīng)原性。
　　(2)兔抗VP6多克隆抗體的制備
　　用相同體積弗氏完全佐劑(FCA)乳化純化的1mg（1mg/ml）VP6蛋白，分點(diǎn)皮下注射新西蘭白兔，兩周之后，用相同劑量的弗氏不完全佐劑(FIA)乳化的VP6蛋白加強(qiáng)免疫一次，十天之后，第三次加強(qiáng)免疫，之后收集血清，用間

6、接ELISA方法檢測(cè)抗體滴度，其中抗原包被板包被的VP6蛋白量為1μg每孔。利用商業(yè)化的親和層析柱純化多克隆抗體。
　　(3)抗原捕獲ELISA方法的建立
　　用抗VP6的蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照，利用棋盤(pán)滴定法篩選兔抗VP6多抗，鼠抗VP6單抗和HRP-羊抗鼠單抗的最佳抗體滴度。用100μl含250ng兔抗VP6蛋白多抗的包被液（0.05M碳酸鈉-碳酸氫鈉，pH9.6）包被整個(gè)聚苯乙烯微量滴定96孔板，使用200μl的封閉液（磷酸

7、鹽緩沖液稀釋的3％ BSA+0.05％吐溫-20; PBST）覆蓋空白區(qū)域和阻斷非特異性反應(yīng)。96孔板使用50μl/孔、10％(w/v)含PoRV的糞便上清孵育，鼠抗VP6單抗使用封閉液稀釋(1％BSA)，HRP羊抗鼠IgG(ABclonal，USA)按1∶10000的稀釋比例稀釋?zhuān)靠?00μl，上述每一步于37℃作用1h，并用洗滌液(PBST)洗滌4次，最后，每孔加100μl TMB顯色，使用ELx800 Absorbance Re

8、ader(BioTek，Winooski，VT，USA)測(cè)量波長(zhǎng)為630nm時(shí)的吸光值。使用25頭A群輪狀病毒陰性豬的糞便樣品檢測(cè)，以0D平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為判定臨界值。結(jié)果顯示AC-ELISA的檢測(cè)靈敏度與常規(guī)RT-PCR相同（約102.5 TCID50/ml）。為了驗(yàn)證建立的AC-ELISA方法，從中國(guó)不同省份的豬場(chǎng)中共收集了295份豬腹瀉糞便樣品，用該檢測(cè)方法與傳統(tǒng)RT-PCR以及RT-qPCR對(duì)比，結(jié)果，該方法的敏感性和特異性

9、與RT-qPCR的符合率分別為91.67％和100％，因此，這兩種方法的檢測(cè)結(jié)果具有高度的一致性(kappa=0.972)。AC-ELISA，傳統(tǒng)RT-PCR和RT-qPCR的樣品檢出率分別為11.2％，11.5％和12.2％，三種檢測(cè)方法之間沒(méi)有顯著性差異。此外，AC-ELISA檢測(cè)方法在流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、偽狂犬病毒和豬圓環(huán)病毒2型之間沒(méi)有交叉反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果顯示建立的AC-ELISA方法具有快速、高特異性和高敏感性的特

10、點(diǎn)，可以用于豬場(chǎng)輪狀病毒病的大規(guī)模監(jiān)控和臨床快速檢測(cè)。
　　3.基于多抗的AC-ELISA方法的建立
　　試驗(yàn)也構(gòu)建了一種檢測(cè)豬A群輪狀病毒的簡(jiǎn)易、快速、低成本、高度特異性和敏感性的抗VP6蛋白和PoRVA(RVA/Pig-wt/CHN/TM-a/2011/G9P23)的多克隆抗體。用間接ELISA、western-blot和間接免疫熒光的方法驗(yàn)證了該多克隆抗體的檢測(cè)效率。AC-ELISA方法檢測(cè)PoRVA蛋白的閾值為50n

11、g/mL。用AC-ELISA，RT-qPCR和商業(yè)化的輪狀病毒AC-ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了295份豬腹瀉樣品，結(jié)果顯示，AC-ELISA方法的敏感性與特異性RT-qPCR相比陽(yáng)性檢出率分別為94.4％和100％。另外，AC-ELISA在檢測(cè)PEDV，TGEV，PRV和PCV2等病毒時(shí)沒(méi)有任何交叉反應(yīng)，因此，AC-ELISA方法可以有效的檢測(cè)臨床樣品的豬A群輪狀病毒。
　　4.當(dāng)前豬輪狀病毒基因型的鑒定
　　目前，具有G5

12、和P[7]組合的PoRVA主要在仔豬中流行。然而，最近的研究已經(jīng)證明，在人和仔豬中共有的G基因型PoRVA正在全世界出現(xiàn)。然而，目前還沒(méi)有關(guān)于中國(guó)不同G基因型PoRVA所占比例的研究。因此，2015年1月至2016年6月，試驗(yàn)一共從中國(guó)16個(gè)省的40個(gè)豬場(chǎng)收集了295個(gè)由腹瀉仔豬糞便組成的臨床樣本。在這40個(gè)豬場(chǎng)中，有15個(gè)豬場(chǎng)檢測(cè)到了輪狀病毒(37.7％)。輪狀病毒可以在一年任意月份穩(wěn)定檢測(cè)到，且不同月份之間沒(méi)有顯著差異。從中成功測(cè)序

13、了17個(gè)樣品，對(duì)總共67種網(wǎng)上來(lái)源和背景清楚的中國(guó)PoRVA毒株（包括在本研究中檢測(cè)的17種毒株的VP7序列和從GeneBank下載的49種）的VP7基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。在13個(gè)G9基因型中，12個(gè)毒株與PoRVA YNR毒株同源性高(99％)。結(jié)果表明，在本研究中17個(gè)分離的毒株中，G9型(76.5％，13/17)是最多見(jiàn)的基因型，其次是G5(17.6％，3/17)和G11(5.9％，1/17)型。此外，67株RVA的VP7序列將