轉(zhuǎn)TaEDR1反義基因抗白粉病小麥的選育.pdf

1、由白粉菌(Blumeriagraminis(DC.)E.O.Speer f.sp.tritici Em.Marchal,Bgt)引起的白粉病是嚴重危害小友(Triticum aestivum L.)生產(chǎn)的世界性病害。隨著抗病分子生物學的發(fā)展,小麥抗白粉病相關(guān)基因的克隆研究進展很快。研究小麥抗病分子機理,了解抗病信號傳導途徑,發(fā)掘信號途徑中的關(guān)鍵調(diào)控基因?qū)檗D(zhuǎn)基因抗病小麥的選育奠定理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究參考擬南芥抗病分子機理研究結(jié)果,通過

2、RACE技術(shù)克隆了一個推測的小麥抗病負調(diào)控基因TaEDR1,用抑制基因表達技術(shù)將目標基因的一個反向片段插入到雙元表達載體中,轉(zhuǎn)入高產(chǎn)小麥品種‘周麥18’,獲得了轉(zhuǎn)基因植株。具體研究結(jié)果如下:
　　 1、TaEDR1基因的克隆和鑒定。用RACE技術(shù)對經(jīng)白粉菌誘導24 h的小麥-黑麥1BL/1RS易位系99/2439葉片的cDNA進行擴增,獲得了與大麥HvEDR1基因高度同源的小麥基因全長cDNA克隆(GenBank登錄號:AY74

3、3662),命名為TaEDR1基因。TaEDR1基因cDNA全長3050 bp,編碼959個氨基酸組成的多肽。高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化功能域存在于TaEDR1的羧基末端。首次提供了證明普通小麥中存在EDR1基因同源物的分子證據(jù)。利用半定量RT-PCR技術(shù),研究了TaEDR1基因的表達,發(fā)現(xiàn)該基因在白粉菌誘導后的葉片中表達有所增強,在葉、穗、莖、根中均有表達。
　　 2、反義TaEDR1基因表達載體的構(gòu)建。把TaEDR

4、1基因編碼N-端區(qū)域的片段反向插入到表達載體pAHC25中,構(gòu)建成反義RNA植物表達載體。通過PCR技術(shù)用加有艤酶切位點的一對特異性引物擴增連接有目的基因的表達載體pCAMBIA-1301/220U-anti-TaEDR1,同時酶切擴增產(chǎn)物和表達載體pAHC25分別得劍TaEDR1基因片段和pAHC25載體片段,將TaEDR1基因片段反向插入到pAHC25表達載體的單子葉植物高效啟動子Ubi的卜游和終止子nos3上游。表達載體保存于大腸