抗性和敏感小菜蛾(Plutella xylostella)及菜蛾嚙小蜂(Oomyzus sokolowskii)acel基因克隆與序列分析.pdf

1、本研究主要研究溫度對小菜蛾乙酰膽堿酯酶基因(ace1)頻率的影響及抗性、敏感菜蛾嚙小蜂ace1基因部分序列及其氨基酸結(jié)構(gòu)改變與抗藥性的關(guān)系。根據(jù)報道的小菜蛾ace1突變位點，設(shè)計bi-PASA檢測引物，分別檢測高溫和常溫處理對抗性、敏感小菜蛾后代ace1。計算出檢測樣本中ace1不同基因型的比列和ace1基因頻率，從分子水平上證明了溫度對小菜蛾抗性和敏感小菜蛾后代ace1基因型和ace1頻率的影響。 菜蛾嚙小蜂(Oomyzus

2、sokolowskii)是小菜蛾(Plutella xylostella)幼蟲至蛹期的跨期寄生蜂，是目前報道的小菜蛾主要寄生天敵之一。本研究以菜蛾嚙小蜂ace1作為研究對象，分別設(shè)計了簡并和特異性的引物，首次擴(kuò)增得到抗性、敏感性菜蛾嚙小蜂的ace1基因片段，通過比較抗性、敏感性菜蛾嚙小蜂乙酰膽堿酯酶片段發(fā)現(xiàn)兩個突變位點，并與已報道的其他昆蟲、電鰩等生物的乙酰膽堿酯酶序列比較分析，得出有一個突變位點可能與菜蛾嚙小蜂抗性有關(guān)。 本研

3、究的主要結(jié)果如下： 1.通過比對擴(kuò)增出的小菜蛾ace1片段序列，得出該序列與已報道的抗丙硫磷小菜蛾ace1序列同源性較高，突變的位點也與報道的一致(G to C)。因此，可以得出本實驗中所用材料為抗性小菜蛾。 2.bi-PASA檢測實驗，要求設(shè)計四條引物：兩條外側(cè)引物(allele-nonspecific-F和allele-nonspecific-R)，兩條內(nèi)側(cè)引物(allele-specific-F和allele-sp

4、ecific-R)。allele-specific-F的3’端對應(yīng)突變型，allele-specific-R的3’端則對應(yīng)敏感型。外側(cè)引物allele-nonspecific-F和allele-nonspecific-R擴(kuò)增的片段長度348bp；allele-nonspecific-F和allele-specific-R擴(kuò)增的片段長度144bp；allele-specific-F和allele-nonspecific-R擴(kuò)增的片段長度2

5、54bp。 3.采用bi-PASA技術(shù)檢測田間小菜蛾F1代成蟲G227A突變情況，常溫處理F0代作為對照：31.8％突變純合子、63.6％的雜合子和4.6％的野生型。常溫處理的比高溫處理的突變純合子由35.5％降至8.8％，雜合子由61.3％上升至76.9％，而最明顯就是野生型比例由3.2％升高到14.3％。 4.常溫處理的室內(nèi)敏感小菜蛾F1代成蟲比高溫處理的雜合子由32.3％降至30.0％，野生型比例由67.7％升高到

6、70.0％，兩種處理中都沒有檢測到突變純合子。常溫處理F0代作為對照：33.3％的雜合子和66.7％的野生型，沒有檢測到突變純合子。 5.常溫處理的室內(nèi)抗性小菜蛾F1代成蟲比高溫處理的突變純合子由62.5％降至22.6％，雜合子比例由37.5％升高到61.3％，常溫處理中都沒有檢測到野生型，而高溫處理后F1代中野生型占到16.1％。常溫處理F0代作為對照：68.4％的突變純合子，32.6％的雜合子，沒有檢測到野生型。 6

7、.計算溫度處理抗性和敏感小菜蛾F1代成蟲ace1基因頻率，常溫(25.0℃)處理的田間小菜蛾與高溫處理的比較，抗性基因(R)的基因頻率從66.1％降至47.1％，敏感基因(S)的基因頻率則從33.9％升至52.9％。對于室內(nèi)篩選敏感小菜蛾(經(jīng)過相同處理)抗性基因(R)的基因頻率從16.1％降至15.0％，敏感基因(S)的基因頻率則從83.9％升至85.0％，而室內(nèi)篩選抗性小菜蛾抗性基因(R)的基因頻率從81.3％降至53.2％，敏感基因

8、(S)的基因頻率則從18.7％升至46.8％。對比常溫處理的抗性、敏感小菜蛾F0代，高溫處理后抗性基因(R)的基因頻率都降低。 7.得到的抗性、敏感菜蛾嚙小蜂的ace1序列和其他昆蟲、電鰩等生物的乙酰膽堿酯酶氨基酸序列進(jìn)行比對分析，有分析結(jié)果證明了我們克隆到的是ace1基因序列。并發(fā)現(xiàn)兩個突變位點即：Phe272Leu(TTT to CTT)、Lys303Arg(AAG to AGG)。通過與其他昆蟲比較分析，可知Phe272L