浙江省規(guī)模化豬場副豬嗜血桿菌分離株的耐藥性及耐藥基因分析.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，Hps)是豬Glasser's病的病原體，引起豬多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。抗生素對(duì)防控該病起到積極作用，但是由于抗菌素的不合理應(yīng)用，造成副豬嗜血桿菌產(chǎn)生耐藥性。本論文針對(duì)養(yǎng)殖場副豬嗜血桿菌感染的問題，對(duì)從浙江省一些規(guī)?；B(yǎng)殖場分離到的副豬嗜血桿菌進(jìn)行抗生素的藥敏試驗(yàn)，并分析了相關(guān)耐藥基因，為養(yǎng)豬生產(chǎn)控制副豬嗜血桿菌病提供參考。
　　自2009年9月

2、到2012年4月，從浙江省杭州、衢州、嘉興、紹興和金華等地區(qū)規(guī)?；i場采集典型副豬嗜血桿菌感染病豬的肺、脾、胸腔液、腹腔液、關(guān)節(jié)液等病料。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)、分離、純化、染色、PCR鑒定得到73株副豬嗜血桿菌菌株。采用K-B瓊脂紙片法對(duì)73株復(fù)壯Hps浙江株進(jìn)行了7類常用抗生素的敏感性試驗(yàn)。
　　結(jié)果顯示:僅3株Hps對(duì)所有的抗生素敏感，5株只對(duì)一種抗生素耐藥，65株至少對(duì)兩種以上的抗生素具有抵抗能力，多重耐藥菌株占比為89.04

3、％。對(duì)磺胺類藥物耐藥的分離株比例高達(dá)86.30％，對(duì)四環(huán)素類、氨基糖苷類、喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類和氯霉素類抗生素耐藥比例分別為65.75％、60.27％、50.68％、、50.68％和46.58％，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥為28.77％。Hps的耐藥情況隨著時(shí)間的變化而有所不同，Hps對(duì)β-內(nèi)酰胺類的耐藥率由70％下降到21％，對(duì)氯霉素類的耐藥率由50％下降到26％，對(duì)磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類、氨基糖苷類的耐藥率維持在40％以上，對(duì)大環(huán)

4、內(nèi)酯類的耐藥率則維持在較低的水平。不同地區(qū)分離到的Hps的耐藥譜也有較大的差異，自杭州、湖州、紹興分離株最耐受磺胺類藥物，而金華、嘉興的分離株最耐受四環(huán)素類藥物。
　　采用煮沸法提取Hps浙江株的DNA，作為PCR擴(kuò)增模板。對(duì)文獻(xiàn)中已報(bào)道的11個(gè)相關(guān)耐藥基因Sul1、Sul2、TEM-11、Flor、CmlA、Cat1、TetA、TetB、 ErmB、Aac(6')-1b、AadA1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)序列測定，并與GenB

5、ank中的相應(yīng)耐藥基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，吻合率達(dá)99％以上的確定為陽性。進(jìn)一步計(jì)算Hps浙江株的耐藥表型和基因型的符合率，以驗(yàn)證該基因是否跟耐藥性相關(guān)。
　　結(jié)果顯示:73個(gè)分離株中，97.26％的菌株中檢測到耐藥基因，多重耐藥的占84.93％。喹諾酮類耐藥基因Aac(6')-1b的檢出率為76.71％，表型符合率為75.68％，提示Aac(6')-1b是Hps浙江株對(duì)喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要耐藥基因。氨基糖苷類耐藥基因

6、AadA1的檢出率為65.75％，表型符合率為66.67％，提示AadA1是Hps浙江株對(duì)氨基糖苷類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要耐藥基因。耐磺胺類耐藥基因Sul1的檢出率(45.20％)高于SUL2的檢出率(8％)，耐藥表型符合率為62.07％，提示Sul1可能是豬源Hps浙江株對(duì)磺胺類藥物耐藥的主要基因。氯霉素類耐藥基因Cat1的檢出率(58.90％)高于Flor(15.07％)和CmlA(8.22％)，耐藥表型的符合率達(dá)70％，提示Cat1

7、是Hps浙江株對(duì)氯霉素類藥物耐藥的主要基因。四環(huán)素耐藥基因TetB的檢出率達(dá)(41.89％)高于TetA(4.11％)，耐藥表型的符合率高達(dá)80.56％，進(jìn)一步驗(yàn)證了TetB是介導(dǎo)Hps浙江株對(duì)四環(huán)素類藥物產(chǎn)生耐藥的主要耐藥基因。β-內(nèi)酰胺類耐藥基因Tem-11的檢出率為35.62％，表型符合率為74.29％，提示Tem-11是Hps對(duì)β-內(nèi)酰胺酶類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要耐藥基因。耐大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ErmB的檢出率為1.37％。表型符合

8、率為0，提示ErmB不是Hps浙江株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類的主要耐藥基因。
　　耐藥基因的檢出率隨時(shí)間的不同有明顯變化，攜帶耐β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因菌株的檢出率由47％下降到26％，攜帶氨基糖苷類藥物耐藥基因菌株的檢出率由75％下降到58％，攜帶耐氯霉素類耐藥基因菌株的檢出率由63％上升到79％，對(duì)耐四環(huán)素類、喹諾酮類耐藥基因檢出率未出現(xiàn)規(guī)律性變化。不同的地區(qū)分離的Hps菌株攜帶的耐藥基因也是不同的，杭州、湖州、嘉興和寧臺(tái)溫分離株中氯霉素