魚(yú)用中藥制劑“天然漁康”的研究開(kāi)發(fā).pdf

1、我國(guó)漁業(yè)自1990年起總產(chǎn)量連年位居世界首位，占全球水產(chǎn)品總產(chǎn)量的四分之一以上，呈現(xiàn)持續(xù)上升、穩(wěn)步發(fā)展的大好局面。但水產(chǎn)品質(zhì)量安全令人擔(dān)憂(yōu)，迫切需要解決病害防治、藥物殘留、禁用藥物禁而不止等問(wèn)題。中草藥應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)疫病防治，既能解決上述問(wèn)題，又經(jīng)濟(jì)。為此，我們開(kāi)展了魚(yú)用中藥制劑“天然漁康”的研究開(kāi)發(fā)。
　　 1不同中藥組方的篩選
　　 用四個(gè)中藥組方對(duì)淡水魚(yú)常見(jiàn)致病菌進(jìn)行抑菌效果對(duì)比試驗(yàn)，初步篩選中藥組方。結(jié)果表明：由黃芩

2、、魚(yú)腥草、大黃、大蒜組成的Ⅰ號(hào)方，由黃芩、蒲公英、黃連、魚(yú)腥草等組成的Ⅱ號(hào)方，和以大黃、五倍子、側(cè)柏葉、大蒜等組成的Ⅳ-1、Ⅳ-2號(hào)組方具有較強(qiáng)的抗菌性；由板蘭根、魚(yú)腥草、地錦草、敗醬草等組成的Ⅲ號(hào)配方抗菌性最弱；以大黃、五倍子、側(cè)柏葉、大蒜等構(gòu)成的Ⅳ-3、Ⅳ-4號(hào)組方抗菌活性最強(qiáng)。各組方對(duì)嗜水氣單胞菌、哈唯弧菌、豚鼠氣單胞菌、鰻弧菌、舒伯特氣單胞菌、腸型點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌、熒光假單胞菌等7種常見(jiàn)病原菌的MBC/MIC為：除Ⅱ號(hào)組方58-2

3、0-9的MBC/MICO為16外，其余各組方的MBC/MIC為2、4、8，均小于16，具有高度敏感性，說(shuō)明這些組方對(duì)這7種病原菌具有較好的殺滅作用。
　　 2“天然漁康”的制備工藝研究
　　 為制備“天然漁康”，篩選了大黃中大黃總蒽醌和五倍子中沒(méi)食子酸提取的最佳工藝條件。一是根據(jù)大黃總蒽醌的理化特性，對(duì)大黃中提取大黃總蒽醌進(jìn)行回流、滲漉、溫浸三種提取方法考察；選擇提取溶劑、溶劑濃度、提取次數(shù)、提取時(shí)間等因素進(jìn)行正交優(yōu)化試

4、驗(yàn)。二是根據(jù)五倍子中沒(méi)食子酸的理化物性，對(duì)五倍子中提取沒(méi)食子酸的酸種及其濃度進(jìn)行考察。大黃中提取大黃素以回流方法最佳，總蒽醌的含量可達(dá)1.95％，高于溫浸法所得的1.24％、滲漉法所得的0.90％；確立了提取總蒽醌工藝：藥材粗粉加8倍量70％的乙醇回流2次，第一次5倍量乙醇2h，第二次3倍量乙醇1h,可獲得大黃素含量＞0.321mg/mL、轉(zhuǎn)移率＞80％。五倍子用酸水解提取沒(méi)食子酸，結(jié)果硫酸水解比鹽酸好，最佳提取工藝為用2.8mol/L

5、硫酸水解3h，其提取物中沒(méi)食子酸的含量可達(dá)63.91％。本工藝合理可行，有利于“天然漁康”的生產(chǎn)。
　　 3 TLC-HPLC法檢測(cè)“天然漁康”中的大黃素
　　 建立了一種快速靈敏的測(cè)定純中藥制劑“天然漁康”中的大黃有效成分的TLC-HPLC法。大黃200g、側(cè)柏葉509粉碎成粗粉，用70％乙醇適量加熱回流，冷卻至室溫，濾過(guò)，減壓濃縮至適量；以硅膠G為吸附劑，正己烷-醋酸乙酯-甲酸(30:10:0.5)為展開(kāi)劑。色譜柱為

6、漢邦Lichrospher C18柱（4.6×150mm,5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1％磷酸溶液(85:15)；柱溫27℃；檢測(cè)波長(zhǎng)245nm;流速為1.0mL/min。該方法的線性范圍為0.086～1.72μg,r=0.99995（n=5）；平均回收率(n=5)為97.8％,RSD=1.8％。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于“天然漁康”的質(zhì)量控制。
　　 4“天然漁康”的急性毒性試驗(yàn)研究
　　 按照《新漁藥臨床檢驗(yàn)

7、規(guī)范》中檢驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，在pH為6.8～7.5，水溫23～25℃條件下，設(shè)100、500、1000和3000 mg/kg·bw4個(gè)染毒劑量組和不加藥的空白對(duì)照組進(jìn)行試驗(yàn)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，以24h、48h、96h內(nèi)試驗(yàn)魚(yú)致死的最低劑量和下一個(gè)劑量為最低致死劑量范圍，并計(jì)算出致死率。根據(jù)直線內(nèi)插法求出24h、48h、96h的半致死量(LD50)，“天然漁康”鯉魚(yú)的96hLD50＞3000mg/kg魚(yú)重。建鯉在整個(gè)使用“天然漁寶”過(guò)程中其攝

8、食、體色、糞便、行為活動(dòng)等均無(wú)異常改變，與對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯不同。
　　 5“天然漁康”的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)研究
　　 參照《新漁藥臨床檢驗(yàn)規(guī)范》要求，對(duì)純中藥制劑“天然漁康”應(yīng)用于建鯉進(jìn)行長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)。在整個(gè)用藥過(guò)程中，建鯉攝食、體色、糞便、行為活動(dòng)、主要器官解剖觀察等均無(wú)異常改變。建鯉體重在給藥期間均增長(zhǎng)，與對(duì)照組相比，添加2％組的增重率顯著(P＜0.05)提高了22.67％;添加0.5％、1％和4％組增重率分別提高了1.

9、27％,6.16％，16.68％。
　　 根據(jù)新漁藥研究開(kāi)發(fā)要求，對(duì)“天然漁康”進(jìn)行魚(yú)類(lèi)主要病原菌抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，其對(duì)淡水魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性敗血癥病原菌BSK-10、豚鼠氣單胞菌ST78-3-3、鰻弧菌E-3-11、舒伯特氣單胞菌CR79-1-1、熒光假單胞菌56-12-10的MIC與MBC均為25μl/L;對(duì)腸型點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌58-20-9的MIC與MBC均為5000μl/L，可用于這些病原菌所致相應(yīng)疾病的防治。
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10、“天然漁康”對(duì)細(xì)菌性敗血癥的防治試驗(yàn)
　　 根據(jù)《漁藥臨床試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范》要求，對(duì)“天然漁康”淡水魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性敗血癥的防治試驗(yàn)。結(jié)果：對(duì)鯉魚(yú)人工感染嗜水氣單胞菌保護(hù)率高劑量組（餌料添加量0.5％）為78.57％，中劑量組（餌料添加量0.1％）為85.72％，低劑量組（餌料添加量0.05％）為49.99％，藥物對(duì)照組藥物保護(hù)率為64.29％。“天然漁康”為魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性敗血癥等疾病的防治提供了一個(gè)新途徑。
　　 8“天然漁康”的臨