Eimeria tenella馬杜霉素耐藥株與同源敏感株不同階段蛋白質(zhì)的差異分析.pdf

1、柔嫩艾美爾球蟲(Eimeria tenella)是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的全球性雞球蟲病原之一。目前，球蟲病的控制主要依賴于藥物預(yù)防，但是由于抗球蟲藥的廣泛使用，尤其是抗球蟲藥作為飼料添加劑長(zhǎng)期拌料使用，使雞球蟲不可避免地產(chǎn)生了耐藥性，因而揭示球蟲耐藥性產(chǎn)生的機(jī)理對(duì)球蟲病的預(yù)防及開發(fā)新的治療藥物具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。球蟲與其他許多物種不同，有著復(fù)雜的生活史，其卵囊期、胞子期、及裂殖體期具有不同的型態(tài)，其生理結(jié)構(gòu)也有巨大的差異，并且具有不同的蛋

2、白質(zhì)及酶表達(dá)。對(duì)這些蛋白進(jìn)行研究為球蟲耐藥性機(jī)理的深入探討有著重要的意義。有關(guān)艾美爾球蟲的蛋白質(zhì)組研究處于剛起步階段，國內(nèi)外有關(guān)報(bào)道尚不多見。 本試驗(yàn)利用雙向電泳技術(shù)找出了E．tenella馬杜霉素耐藥株與同源敏感株在第二代裂殖、未孢子化卵囊、孢子化卵囊時(shí)期表達(dá)差異較大的蛋白，采用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)合生物信息學(xué)檢索對(duì)它們的功能進(jìn)行初步研究。主要內(nèi)容： 1．E．tenella馬杜霉素耐藥株與同源敏感株不同階

3、段蛋白電泳的比較研究 用E．tenella馬杜霉素耐藥株及其同源敏感株分別感染2周齡無球蟲羅曼小公雞，分別從雞盲腸和糞便收取兩個(gè)蟲株第二代裂殖子、未孢子化卵囊、孢子化卵囊4℃下保存?zhèn)溆?。采用EDAE凝膠純化球蟲，對(duì)比了TCA/丙酮沉淀法、劉文江法及直接研磨高速離心法的效果，選擇了直接研磨高速離心法結(jié)合HiTrap Desalting脫鹽，冷凍干燥系統(tǒng)濃縮蛋白的E．tenella雙向電泳樣品制備方案，解決了困擾雙向電泳研究的鹽離子

4、濃度偏高和蛋白濃度控制的問題。 將制備的蛋白樣品進(jìn)行SDS—PAGE，凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，利用Imagemaster VDS軟件系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在孢子化階段馬杜霉素耐藥株與敏感株相比有一條高表達(dá)的蛋白質(zhì)帶，其分子量約為21.5kD，相對(duì)含量23.0％；第二代裂殖子及未孢子化卵囊階段的蛋白質(zhì)相對(duì)含量沒有明顯差異。進(jìn)一步研究，試驗(yàn)采用雙向電泳技術(shù)蛋白質(zhì)上樣量150μg，pH3-1017cm IPG干膠條(BIO—RA

5、D)用PROTEAN IEF Cell等電聚焦儀進(jìn)行等電聚焦，設(shè)定總聚焦60，000Vh，平衡后轉(zhuǎn)移至PROTEANⅡ xi Cell電泳槽以0.5mm12％均勻膠進(jìn)行垂直電泳SDS—PAGE，在對(duì)凝膠銀染后，用Image MasteTM2D Elite軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：E．tenella馬杜霉素耐藥株與同源敏感株的第二代裂殖子、未孢子化卵囊、孢子化卵囊2-DE圖譜分別識(shí)別到900±73、900±25、200±14、200±

6、11、200±51、200±43個(gè)蛋白點(diǎn)，其中大部分蛋白點(diǎn)分布于15～100kD，等電點(diǎn)3.5～9.5之間。對(duì)比這些蛋白點(diǎn)發(fā)現(xiàn)馬杜霉素耐藥株與敏感株間平均匹配率約88％～92％且三個(gè)階段均有表達(dá)差異的蛋白點(diǎn)，它們主要分布在分子量21～28KD、35～45KD，66～90KD等電點(diǎn)3.5～8.0之間的區(qū)域。 2．E．tenella馬杜霉素耐藥株與同源敏感株差異蛋白MALDI—TOF MS分析 選取E．tenella馬杜霉素

7、耐藥株與同源敏感株3階段2-DE圖譜中15個(gè)分離明顯的差異蛋白點(diǎn)(其中馬杜霉素株特異點(diǎn)9個(gè)，同源敏感株特異點(diǎn)6個(gè))，進(jìn)行MAIDI—TOF—MS肽指紋圖譜分析，經(jīng)在線Mascot軟件(http：//www．Matrixscience．com)在NCBInr檢索鑒定出12個(gè)蛋白和3個(gè)猜想蛋白。分析結(jié)果顯示，在這15種差異表達(dá)的蛋白中，大部分屬于蛋白酶類，與細(xì)胞內(nèi)糖代謝、多胺代謝、能量代謝等相關(guān)，如endonuclease V(核酸內(nèi)切酶V

8、)、carboxy—lyase(羧酸分解酶)、porphobilinogen deaminase(膽色素源脫氨基酶)、beta—N—acetylglucosaminid—aseisoform A(β—N—乙酰氨基己糖糖苷酶)；有些與免疫相關(guān)，如免疫蛋白1C2和A6、LT2(ATP酶分子伴侶)、ATCC49188(分泌蛋白)、ANA-3(染色體分離蛋白)；有些與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，如HTCC2150(ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)、RAB36(RAS家族

9、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)；有些參與蟲體的構(gòu)成，如Strongylocentrotus purpumtus(肌動(dòng)蛋白集束)。其中在馬杜霉素耐藥株中特異表達(dá)蛋白DSM3645、SD-21、ATCC49188及Strongylocentrotus purpuratus和高表達(dá)蛋白endonucleaseV、HTCC2150、RAB36、ANA-3及LT2主要分布在孢子化和第二代裂殖子階段，推測(cè)耐約株球蟲主要在此兩階段產(chǎn)生某些代謝機(jī)制來抵御藥物的侵襲，這將對(duì)