草魚纖維素分解菌篩選、酶提純及其相關(guān)活性研究.pdf

1、纖維素主要存在于植物的細(xì)胞壁中，是自然界中存在最廣泛的一類碳水化合物，同時(shí)它也是地球上數(shù)量最大的可再生資源。由于纖維素分子是以β-1，4糖苷鍵相連接而形成的直鏈多糖，在自然狀況下難以降解成可以利用的二糖或單糖等短鏈低聚糖，利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶將其轉(zhuǎn)化為人類可以直接利用的物質(zhì)，解決急需的能源、食物和化工原料等，是科學(xué)界長期研究的課題之一，這對(duì)于人類社會(huì)解決環(huán)境污染、食物短缺和能源危機(jī)等具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 研究表明，自然

2、界中許多陸生真菌和細(xì)菌能夠產(chǎn)纖維素酶。真菌產(chǎn)生的纖維素酶類通常為酸性酶，最適PH在3-5之間，在堿性范圍內(nèi)無活性或活性很低，且多數(shù)靠固態(tài)發(fā)酵來產(chǎn)纖維素酶，這使得真菌纖維素酶的應(yīng)用和產(chǎn)量受到一定的限制；細(xì)菌所產(chǎn)生的纖維素酶一般適應(yīng)中性至偏堿性環(huán)境，由于相應(yīng)的酶對(duì)天然纖維素的水解作用較弱，長期以來其開發(fā)利用沒有得到足夠的重視，近年，隨著中性和堿性纖維素酶在棉織品水洗整理工藝及洗滌劑工業(yè)中的成功應(yīng)用，細(xì)菌纖維素酶已顯示出良好的使用性能和經(jīng)濟(jì)價(jià)

3、值。細(xì)菌具有結(jié)構(gòu)簡單、繁殖快等特點(diǎn)，是基因工程的主要材料，其液態(tài)深層發(fā)酵具有條件容易控制，不易染雜菌，生產(chǎn)效率高等優(yōu)勢(shì)，使得從細(xì)菌中提取纖細(xì)素酶將可能以其高效性而成為一個(gè)重要的途徑。目前報(bào)道的產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌主要為產(chǎn)芽孢梭菌（Clostridum SP）、類似黃鏈霉菌（．Xanthomonas）、嗜酸纖維素分解菌（Acidothermus Cellulolyticus）等，這些菌株大多為陸生菌株。從水體特別是從水生動(dòng)物體內(nèi)篩選的能產(chǎn)纖維素

4、酶的細(xì)菌菌株報(bào)道甚少。
　　 自然條件下，水生植物是草食性魚類的主要食物來源，從生理適應(yīng)性的角度推斷，此類魚可能具有纖維素的分解能力，從其他陸生食草動(dòng)物的研究成果來分析，這種分解能力應(yīng)來自于腸道中的纖維素分解菌。常見的草食性魚類有草魚（Ctenopharyngodon idellus）、鳊（Parabramis pekinensis）、魴（Megalobramaamblycephala）等，其中生長速度最快，食草量最大的是草魚。

5、本課題以草魚為對(duì)象，就草食性魚類腸道纖維素分解菌進(jìn)行了相關(guān)研究。
　　 實(shí)驗(yàn)中，利用剛果紅選擇平板法，從草魚腸道內(nèi)篩選出四株能產(chǎn)纖維素酶，并具有較高酶活性的細(xì)菌菌株，分別測定了各菌株的內(nèi)切β-葡萄糖苷酶、纖維二糖水解酶和濾紙酶的活力。從細(xì)菌形態(tài)、生理生化和16S rRNA層面上對(duì)纖維素分解菌進(jìn)行了分類鑒定，結(jié)果為阿斯布腸道桿菌（Enterobacter asburiae）和枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis）。

6、r>　　 對(duì)其中X7菌株的液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了研究，初步確定產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)條件為：初始PH值為7.0-7.3，接種量為5％（v/v），培養(yǎng)溫度為37℃；最適培養(yǎng)基為：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）1％（w/v），蛋白胨1％（w/v），KH2PO40.1％（w/v），NaCL0.5％（w/v）。
　　 在最適條件下，液態(tài)培養(yǎng)菌株，通過超聲波破碎細(xì)胞壁、磁力攪拌菌體、離心過濾菌體等方法處理發(fā)酵液，檢測并比較纖維素酶的活性，認(rèn)為該

7、菌株所產(chǎn)的酶為胞外酶。利用鹽析、DEAE-Sephadex A-50離子交換層析，Sephadex G-75凝膠過濾，經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺電泳檢驗(yàn)，初步判定該酶為多亞基結(jié)構(gòu)。
　　 對(duì)純化后的纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。以羧甲基纖維素作為底物時(shí)，該菌株所產(chǎn)纖維素酶的最適宜的催化溫度為55℃，酶反應(yīng)的溫度范圍較寬，在45℃-65℃的溫度范圍內(nèi)，熱穩(wěn)定性良好，在80℃條件下仍殘存有30％的酶活。最適宜的PH值為7.0，在4.0-

8、7.0之間的PH值范圍內(nèi)，酶的活力較穩(wěn)定。Mn2+、Mg2+對(duì)酶的活性有激活作用；Fe2+、Ca2+、Zn2+對(duì)酶的活性有抑制作用；Cu2+、CO2+有明顯的毒害作用。以羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為底物的Km值為5.3×10-3g/ml。
　　 為了解藥物對(duì)纖維素酶產(chǎn)生菌的生長和活性影響，以指導(dǎo)漁用藥物的使用，進(jìn)行了相應(yīng)菌株的藥物試驗(yàn)。抑菌實(shí)驗(yàn)表明：四種菌株對(duì)諾氟沙星、頭孢哌酮、慶大霉素等藥物高度敏感，對(duì)磺胺二甲嘧啶和土霉素