轉(zhuǎn)基因雞生物反應(yīng)器生產(chǎn)人瘦素蛋白的研究.pdf

1、瘦素(leptin)是肥胖基因(obese gene，ob基因)的產(chǎn)物，具有抑制攝食、調(diào)節(jié)脂肪沉積與能量代謝的功能。Leptin的作用除與肥胖有關(guān)外，對(duì)多種生理過(guò)程都有調(diào)節(jié)作用，諸如生熱作用、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用、青春期的始動(dòng)作用、生殖功能等。重組人leptin蛋白對(duì)于部分肥胖以及l(fā)eptin缺乏的個(gè)體或脂肪萎縮性糖尿病患者具有一定的療效。 本研究擬通過(guò)體外克隆人瘦素蛋白基因，進(jìn)行體外表達(dá)和生物學(xué)活性檢驗(yàn)并構(gòu)建重組人瘦素蛋白基因的輸

2、卵管特異性載體，定位表達(dá)重組人瘦素蛋白的思路，旨意探索建立活體雞生物反應(yīng)器生產(chǎn)純天然藥用蛋白的體系探索、新思路。主要研究如下： 1.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)提取人白色脂肪組織總RNA，根據(jù)發(fā)表文獻(xiàn)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，RT-PCR法擴(kuò)增人瘦素蛋白基因OB，并定向克隆至pMD19-T載體進(jìn)行序列分析。結(jié)果：與GenBank發(fā)表的人瘦素蛋白基因CDS(登錄號(hào)：NM000230)的同源性為100％，說(shuō)明所擴(kuò)增的序列為本實(shí)驗(yàn)所要的。 2.通過(guò)雙

3、酶切克隆的人肥胖基因的質(zhì)粒pMD19-T human leptin，獲得人OB基因ORF，定向克隆至原核表達(dá)載體PGEX-6P-1，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PGEX-OB。經(jīng)酶切、PCR鑒定和DNA序列檢測(cè)正確后，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中，構(gòu)建工程菌株BL21-PGEX-OB。37℃培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，人瘦素融合蛋白以包涵體形式高效表達(dá)。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，工程菌株BL21-PGEX-OB正確表達(dá)了重組人瘦素融合蛋白，所表達(dá)

4、的融合蛋白分子為20 KD，大小與理論值相符；IPTG誘導(dǎo)6h，誘導(dǎo)劑IPTG濃度在1mmol/L時(shí)，融合蛋白具有最高表達(dá)量。Genetool分析結(jié)果顯示，目的蛋白最大表達(dá)量達(dá)菌體蛋白總量的30％。 3.雙酶切克隆的人肥胖基因的質(zhì)粒pMD19-T human leptin，獲得人ob基因，定向克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.0，構(gòu)建重組人瘦素真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA-OB，在3T3細(xì)胞中表達(dá)重組人瘦素蛋白，并通過(guò)小鼠減肥實(shí)驗(yàn)來(lái)

5、檢測(cè)人瘦素蛋白生物學(xué)活性。RT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞成功表達(dá)人瘦素蛋白；注射重組質(zhì)粒pcDNA-OB小鼠體重與陰性對(duì)照組相比明顯下降，統(tǒng)計(jì)分析顯示差異極顯著(P<0.01)，說(shuō)明重組人瘦素蛋白具有生物學(xué)活性。 4.以克隆的人肥胖基因的質(zhì)粒pMD19-T human leptin，設(shè)計(jì)帶有特異酶切位點(diǎn)的引物，PCR擴(kuò)增獲得具有相應(yīng)酶切為點(diǎn)的OB基因，定向克隆至輸卵管特異性表達(dá)載體POV3，經(jīng)酶切、PCR鑒定和DNA序