轉(zhuǎn)基因玉米種子中重組植酸酶的提取、純化和酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、植酸酶是可以將植酸分解成無(wú)機(jī)磷和肌醇的一類(lèi)酶，是應(yīng)用最為廣泛的飼料酶添加劑之一，它能夠提高單胃動(dòng)物對(duì)飼料中植酸磷的利用效率，降低植酸磷對(duì)環(huán)境的污染，因此有著非常重要的研究意義。 通過(guò)基因工程技術(shù)將來(lái)源于黑曲霉Aspergillus niger(ficuum)NRRL3135的phyA基因在畢赤酵母(Pichia pastoris)中高效表達(dá)生產(chǎn)植酸酶，已經(jīng)成功產(chǎn)業(yè)化，然而也存在高成本、高耗能等問(wèn)題，利用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)酶制劑可

2、以有效降低生產(chǎn)成本和耗能。 范云六等將植酸酶基因成功轉(zhuǎn)入玉米，獲得能夠生產(chǎn)高活性植酸酶的轉(zhuǎn)基因玉米。 本論文以上述轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米種子為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)對(duì)提取條件、硫酸銨分級(jí)沉淀濃縮條件、陰離子交換層析純化等方面的優(yōu)化，建立了植酸酶提取和純化的標(biāo)準(zhǔn)流程，為更進(jìn)一步的研究植酸酶提供了豐富的樣品，也為今后從玉米種子中提取純化其他重組蛋白提供了可借鑒的經(jīng)驗(yàn)。 經(jīng)探索發(fā)現(xiàn)用pH3.0的Gly-HCl緩沖液在液固比10的條件

3、下室溫720 rpm震蕩0.5h提取的植酸酶比活最高，為最佳提取條件。粗提液中的植酸酶在60～80％硫酸銨飽和度時(shí)絕大部分可以沉淀下來(lái)，且比活最高，為最佳濃縮條件。 濃縮的酶液用陰離子交換層析純化，穿透峰為雜質(zhì)，不含植酸酶蛋白；洗脫峰為植酸酶蛋白，達(dá)到SDS-PAGE電泳純，可以直接測(cè)定酶學(xué)性質(zhì)。 對(duì)比玉米/酵母表達(dá)的植酸酶酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)兩種酶的最適pH均為5.8，在pH2.0有第二個(gè)較小的峰值； 在pH2.0～

4、8.0之間均較為穩(wěn)定；玉米表達(dá)的植酸酶最適溫度為45℃，而酵母表達(dá)的植酸酶最適溫度為50℃； 在80℃下保溫1h，玉米表達(dá)植酸酶剩余活性在30％以上，而酵母表達(dá)植酸酶剩余活性在11％左右，玉米表達(dá)植酸酶熱穩(wěn)定性?xún)?yōu)于酵母表達(dá)植酸酶； 在0-30min內(nèi)酶活性與反應(yīng)時(shí)間的比值均保持穩(wěn)定； 玉米表達(dá)的植酸酶Km=0.202mmol/L，Vmax=47mmol/min，酵母表達(dá)的植酸酶Km=0.355mmol/L，Vma