PPV和PRV診斷方法的建立及PPV-PRV二聯(lián)滅活疫苗免疫效力試驗(yàn).pdf

1、豬細(xì)小病毒病和偽狂犬病都是引起母豬繁殖障礙的主要疾病。豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒（PPV）引起的，豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒（PRV）引起的。這兩種疾病在世界范圍內(nèi)廣泛分布，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了有效預(yù)防這兩種疾病，本試驗(yàn)建立了檢測(cè)PPV和PRV的TaqMan熒光定量PCR方法以及檢測(cè)PPV抗體的ELISA方法，并利用豬細(xì)小病毒BQ-C株和豬偽狂犬病毒ΔgE株，試制了PPV-PRV二聯(lián)滅活疫苗，對(duì)試制的疫苗免疫效力進(jìn)行了初步試

2、驗(yàn)。
　　本研究針對(duì)PPV VP2基因和PRV gB基因序列，建立了檢測(cè)PPV和PRV的TaqMan熒光定量PCR方法。結(jié)果表明所建立的TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法敏感性較高，特異性較好，批間、批內(nèi)變異系數(shù)均小于3％，其中針對(duì)PPV VP2基因的熒光定量PCR方法可檢測(cè)到13拷貝的初始模板，針對(duì)PRV gB基因的熒光定量PCR方法可檢測(cè)到167拷貝的初始模板，敏感性是常規(guī)PCR方法的100倍。
　　本研究利用桿狀病毒載

3、體表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)VP2蛋白（rVP2）作為抗原，建立了檢測(cè)PPV抗體的間接ELISA方法。經(jīng)條件優(yōu)化其最佳抗原包被濃度為10μg/mL，最佳酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為10000倍，最佳包被液為0.01mol/L碳酸鹽緩沖液（PH=9.6），最佳封閉液為5%的脫脂乳-PBS，最佳封閉時(shí)間為90 min，最佳血清稀釋倍數(shù)為200倍，其陽性Cut-off值為0.3。用該方法與商品化ELISA試劑盒分別檢測(cè)360份臨床血清樣品，結(jié)果表明建立的ELISA方

4、法檢測(cè)PPV抗體陽性率為75.00%，商業(yè)化ELISA試劑盒檢測(cè)PPV抗體陽性率為75.83%，二者符合率為94.17%。
　　本研究利用本實(shí)驗(yàn)室保存的PPV-BQ-C毒株和rPRV-ΔgE毒株制備病毒液作為該二聯(lián)疫苗的抗原，利用β-丙內(nèi)酯將病毒液滅活，將上述滅活的兩種病毒液以PPV-BQ-C︰rPRV-ΔgE=2︰1的比例混合均勻，以抗原︰佐劑=8.5︰1.5的比例乳化制成疫苗。對(duì)疫苗進(jìn)行初步檢驗(yàn)后免疫后備母豬，二聯(lián)疫苗于免疫后

5、四周PPV HI抗體水平達(dá)到高峰，PPV-PRV二聯(lián)滅活疫苗組HI抗體水平為1﹕776，PPV商業(yè)滅活疫苗組HI抗體水平為1︰445，免疫后PPV-PRV二聯(lián)滅活疫苗組PRV中和抗體水平最高為1︰59.46，PRV商業(yè)苗組PRV中和抗體水平最高為1︰32.70。為了研究PPV-PRV二聯(lián)滅活疫苗的免疫保護(hù)效力，對(duì)免疫后的后備母豬分別用PPV和PRV強(qiáng)毒攻擊，通過檢測(cè)母豬各組織中的病毒載量來評(píng)價(jià)疫苗的保護(hù)作用。結(jié)果顯示攻毒后4周，攻PPV