番茄Cf-4和Cf-9基因介導(dǎo)的過(guò)敏性反應(yīng)調(diào)控基因的篩選和鑒定.pdf

1、番茄(Solanum lycopersicum)與葉霉病菌(Cladosporium fulvum)互作符合基因?qū)蚣僬f(shuō)，是研究植物與病原互作的模式系統(tǒng)，番茄抗C.fulvum基因(Cf)和葉霉菌的無(wú)毒基因(Avr)產(chǎn)物識(shí)別后激活下游抗病信號(hào)傳導(dǎo)，活化各類防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達(dá)，最終表現(xiàn)抗病性。目前對(duì)Cf下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑的了解還很膚淺。本研究聯(lián)合采用蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)和快速反向遺傳學(xué)基因功能分析技術(shù)——病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus in

2、ducedgene silencing，VIGS)，篩選和鑒定番茄Cf-4和Cf-9介導(dǎo)的過(guò)敏性反應(yīng)調(diào)控基因，獲得了以下主要研究結(jié)果： (1)建立了一套適于番茄子葉總蛋白分離的雙向電泳分析技術(shù)體系。通過(guò)對(duì)雙向電泳中幾個(gè)重要因素，包括上樣量、IPG膠條選擇、上樣方式、聚焦條件等的優(yōu)化，總結(jié)出可以獲得高分辨率、高重復(fù)性結(jié)果的雙向電泳操作體系：使用TCA/丙酮沉淀方法提取番茄子葉總蛋白，采用24cmpH3-7NL的IPG膠條，水化上樣

3、，300μg的上樣量，低電壓除鹽后8000v56000～68000vhs進(jìn)行等電聚焦。 (2)開(kāi)展了番茄抗葉霉病蛋白質(zhì)組學(xué)分析。通過(guò)雙向電泳分析，分別獲取了Cf-4(HR-)、Avr4/Cf-4(HR+)、Cf9(HR-)及Avr9/Cf-9(HR+)基因型番茄苗的蛋白質(zhì)組圖譜。對(duì)四種基因型番茄的蛋白質(zhì)組圖譜的比較分析結(jié)果表明，66個(gè)蛋白在Cf-4(HR-)與Avr4/Cf-4(HR+)基因型番茄苗中差異表達(dá)，其中59個(gè)蛋白在A

4、vr4/Cf-4基因型番茄苗(HR+)中表達(dá)量上調(diào)，7個(gè)下調(diào)；71個(gè)蛋白在Cf-9(HR-)與Avr9/Cf-9(HR+)基因型番茄苗中差異表達(dá)，其中59個(gè)蛋白在Avr9/Cf-9基因型番茄苗(HR+)中表達(dá)量上調(diào)，12個(gè)下調(diào)。Avr9/Cf-9和Avr4/Cf-4這兩個(gè)互作中均差異表達(dá)的蛋白有43個(gè)，其中39個(gè)在Avr9/Cf-9(HR+)和Avr4/Cf-4(HR+)基因型番茄苗中表達(dá)上調(diào)，4個(gè)表達(dá)下調(diào)。同時(shí)分離得到僅在Avr9/C

5、f-9(HR+)和僅在Avr4/Cf-4(HR+)基因型番茄苗中差異表達(dá)蛋白，分別為23個(gè)和28個(gè)， 差異表達(dá)蛋白點(diǎn)切取后進(jìn)行MALDI-TOF-MS和MALDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析，65個(gè)蛋白得到成功鑒定。這些差異表達(dá)蛋白功能主要涉及防衛(wèi)反應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)、代謝、蛋白合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和光合作用等方面。 (3)采用VIGS技術(shù)分析了19個(gè)差異表達(dá)蛋白對(duì)應(yīng)基因的抗病功能。對(duì)差異表達(dá)蛋白的序列進(jìn)行了分析，

6、65個(gè)蛋白編碼基因中的19個(gè)可以在本氏煙或煙草序列數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到氨基酸序列一致率68％以上或編碼的核酸序列一致率80％以上的同源基因。選取這19個(gè)本氏煙或煙草同源基因作為沉默的靶標(biāo)基因，對(duì)其在抗病性中的作用進(jìn)行了檢測(cè)分析。采用RT-PCR擴(kuò)增克隆目的基因片段，并亞克隆至煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)基因沉默載體，在本氏煙上進(jìn)行TRV誘導(dǎo)的VIGS分析，檢測(cè)沉默植株的抗病性表現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)蛋白酶體20Sβ亞基、

7、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)眼結(jié)合蛋白(Luminal-binding protein5，BiP5)、細(xì)胞分化蛋白酶ftsH同源物(Cell division protease ftsH homolog)、促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinasel，MAPK1)、天冬酰胺合成酶(Asparagine synthetase，AS)、ASR4(Abscissic acid，Stress,Ripening)、葉綠體噻

8、唑生物合成蛋白(Chloroplast thiazole biosynthetic protein)等7個(gè)基因沉默后植株表現(xiàn)出壞死、矮化，葉片和花器發(fā)育畸形等癥狀。AS、Pipl(phytophthora-inhibited protease 1)、MAPKl、Lemir(Lycopersicum esculentum miraculin)等4個(gè)基因的沉默顯著減弱了Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9介導(dǎo)的HR，表明這4個(gè)基因?qū)f介

9、導(dǎo)的HR起重要調(diào)控作用。 (4)采用VIGS技術(shù)分析了56個(gè)ACE(Avr/Cfelicited)基因的抗病功能。對(duì)56個(gè)ACE基因在本氏煙上進(jìn)行TRV介導(dǎo)的VIGS分析，其中編碼脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、病程相關(guān)蛋白、細(xì)胞色素P45076A2、細(xì)胞色素P45072A1、60S核糖體蛋白L10、bZIP轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子BZI-2、激酶互作蛋白及一個(gè)未知功能蛋白的8個(gè)ACE基因沉默顯著減輕了Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9介導(dǎo)的HR，表明這些

10、基因可能在Cf-4和Cf-9介導(dǎo)的HR中起重要調(diào)控作用。 (5)采用VIGS技術(shù)分析了8個(gè)泛素介導(dǎo)的蛋白降解途徑基因及2個(gè)鈣離子信號(hào)途徑基因?qū)f介導(dǎo)HR的調(diào)控作用。結(jié)果表明1個(gè)泛素融合降解蛋白(Ubiquitinfusion degradation protein)和2個(gè)鈣離子結(jié)合蛋白(Calcium-binding protein)在Cf-4和Cf-9介導(dǎo)的HR中起作用。 綜上所述，本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定獲取了

11、Cf-4和Cf-9介導(dǎo)HR產(chǎn)生與否差異表達(dá)蛋白，并通過(guò)VIGS方法分析了蛋白質(zhì)組水平和轉(zhuǎn)錄組水平的差異表達(dá)基因在Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9介導(dǎo)的HR中的作用，獲取了一批番茄葉霉病菌抗性調(diào)控基因。同時(shí)，這些研究結(jié)果表明結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)分析和VIGS技術(shù)分析的體系是篩選和鑒定植物抗病調(diào)控基因的有效技術(shù)體系，為其它功能基因的篩選和鑒定提供了借鑒。此外，研究結(jié)果增進(jìn)了對(duì)番茄葉霉病抗性分子機(jī)理的理解，并為番茄葉霉病抗性品種的分子培育提供