血紅素加氧酶-一氧化碳信號系統(tǒng)參與調(diào)控滲透脅迫下小麥種子的萌發(fā)以及幼苗的脫黃化.pdf

1、```近年來,血紅素加氧酶(hemc oxygenase,HO)及其產(chǎn)物一氧化碳(carbon monoxide,CO)的生理作用得到了越來越廣泛的關(guān)注。動物中的研究表明,HO/CO信號系統(tǒng)在細胞對抗氧化傷害的過程中扮演了重要的生理角色。越來越多的實驗結(jié)果證明,HO/CO信號系統(tǒng)在植物體內(nèi)也具有類似的生理效應(yīng)。
　　 在本論文中,我們首先采用不同濃度的聚乙二醇PEG-6000(12.5％、25％和50％)預(yù)處理小麥種子1天,發(fā)現(xiàn)

2、低濃度12.5％PEG可以促進小麥種子的萌發(fā),25％PEG處理明顯降低了其萌發(fā)率,高濃度50％PEG脅迫后的小麥種子則基本不萌發(fā)。在恢復過程中,25％PEG預(yù)處理后的小麥種子可以較快恢復至正常萌發(fā)水平,50％PEG脅迫后的則不能完全恢復。同時觀察了恢復過程中小麥種子內(nèi)膜脂過氧化產(chǎn)物硫代巴比妥酸活性反應(yīng)物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)的含量、HO活性以及HO-1基因表達量的變

3、化。下述結(jié)果表明12.5％和25％PEG均可以顯著誘導其內(nèi)源HO活性以及HO-1轉(zhuǎn)錄本的提高,但12.5％PEG預(yù)處理可誘導恢復過程中小麥種子內(nèi)TBARS含量的下降,25％PEG預(yù)處理則不能；50％PEG脅迫不僅誘導了小麥種子內(nèi)膜脂過氧化水平的提高同時對HO活性以及HO-1基因表達均產(chǎn)生明顯抑制效應(yīng)。因此,我們進一步采用HO-1的誘導劑Hematin處理25％PEG脅迫的小麥種子,發(fā)現(xiàn)Hematin以濃度依賴的方式誘導了25％PEG脅迫

4、下小麥種子的萌發(fā)及根的伸長,其中1.0μmol·L-1Hematin處理效果最為明顯,它不僅可以誘導其內(nèi)源HO活性的增加,并且呈現(xiàn)出時間進程的方式。同時發(fā)現(xiàn)上述Hematin對種子萌發(fā)抑制的緩解效應(yīng)可能是通過提高淀粉酶活性來加速儲藏物質(zhì)的降解和誘導各種抗氧化酶活性上升來降低25％PEG脅迫所造成的氧化損傷的。半定量RT-PCR也得到相同的結(jié)果,小麥種子中過氧化氫酶(catalase,CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorate per

5、oxidase,APX)、錳-超氧化物歧化酶(Mn-superoxide dismutase,Mn-SDD)和銅,鋅-超氧化物歧化酶(Cu,Zn-superoxide dismutas,Cu,Zn-SOD)的轉(zhuǎn)錄水平均有所提高。
　　 為了驗證HO的催化產(chǎn)物CO是否參與了小麥種子對滲透脅迫的響應(yīng)過程,我們同時采用不同稀釋度的CO氣體飽和溶液處理25％PEG脅迫的小麥種子,發(fā)現(xiàn)其具有與上述Hematin類似的緩解效應(yīng)。并且通過測定

6、不同處理后小麥種子中CO的含量,發(fā)現(xiàn)Hematin處理不僅可以顯著誘導25％PEG脅迫下小麥種子中CO的釋放,且CO含量的變化與上述HO活性的變化趨勢一致。加入HO-1的抑制劑鋅原卟啉(ZnPPⅨ)則逆轉(zhuǎn)了上述誘導效應(yīng),初步證明CO也參與調(diào)控滲透脅迫下小麥種子的萌發(fā),內(nèi)源HO/CO信號系統(tǒng)在小麥種子對滲透脅迫的響應(yīng)過程中具有十分重要的生理作用。
　　 我們進一步研究發(fā)現(xiàn)上述Hematin的生理效應(yīng)可能與種子內(nèi)源NO的釋放相關(guān)。H

7、ematin處理可誘導滲透脅迫早期小麥種子內(nèi)NO的釋放。加入NO的專一性清除劑2-(4-羧基苯)-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(cPTIO)逆轉(zhuǎn)了上述Hematin對種子萌發(fā)抑制的緩解效應(yīng).綜上所述,NO可能參與了HO/CO信號系統(tǒng)對滲透脅迫下小麥種子萌發(fā)的調(diào)控過程。
　　 小麥幼苗在黑暗條件下生長會出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。已有文獻報道,NO可以提高黃化小麥幼苗葉片葉綠素的含量。我們的研究發(fā)現(xiàn)在光照恢復過程中,內(nèi)源HO活

8、性、HO-1基因表達以及CO釋放量均顯著提高,加入HO-1的抑制劑ZnPPⅨ,明顯逆轉(zhuǎn)上述光的誘導效應(yīng),表明內(nèi)源HO/CO信號系統(tǒng)參與了光誘導的小麥幼苗的脫黃化過程。同時發(fā)現(xiàn),在不存在光的條件下,Hematin以及CO氣體飽和溶液均可以以濃度依賴的方式緩解黃化小麥幼苗葉片葉綠素的降解。其中,10.0μmol·L-1Hematin和1.0％CO氣體飽和溶液的處理效果最為明顯。此外,與僅經(jīng)過暗誘導黃化的小麥幼苗相比,Hematin和CO氣體

9、飽和溶液處理不僅顯著提高其內(nèi)源HO的活性、光敏色素的總量同時誘導了HO-1基因以及PhyA、PhyB和PhyC前體蛋白基因的表達。硝普鈉(sodium mtropmsside,SNP)處理也具有相同的作用效果。加入動物中一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的抑制劑NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)和NO的專一性清除劑2-(4-羧基苯)-4,4,5,5.四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(cPTIO)明顯

10、阻斷了上述SNP、Hematin以及CO氣體飽和溶液的生理效應(yīng)。同時發(fā)現(xiàn)Hematin和CO氣體飽和溶液可以顯著提高黃化小麥幼苗內(nèi)NO的釋放量,暗示NO可能參與上述HO/CO信號系統(tǒng)調(diào)控的小麥幼苗脫黃化過程。
　　 基于上述實驗結(jié)果,我們推測:外源HO-1的誘導劑Hematin以及CO氣體飽和溶液可能是通過調(diào)動內(nèi)源HO/CO信號系統(tǒng)來進行信號的級聯(lián)放大或者外源CO氣體本身就可以作為信號分子通過與內(nèi)源NO互作來調(diào)控小麥幼苗脫黃化這

11、一生理過程且與光敏色素密切相關(guān)。
　　 為了進一步了解該基因的生理功能,我們以擬南HO-1基因序列為模板進行BLAST得到一系列具有同源性的小麥EST序列,利用生物信息學軟件進行拼接得到小麥HO-1基因序列。利用RT-PCR的方法克隆得到其全長cDNA.聚類分析表明,小麥HO-1基因與其他植物內(nèi)該基因高度同源。對小麥幼苗分別進行NaCl、PEG-6000以及H2O2處理,采用半定量RT-PCR方法對小麥HO-1基因的表達模式進行