基于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的大麥耐鎘性基因型差異及大小麥耐滲透脅迫差異的機(jī)理研究.pdf

1、鎘(Cadmium，Cd)是毒性最強(qiáng)的重金屬污染元素之一。Cd在環(huán)境中的遷移性強(qiáng)，極易被植物吸收積累，超過一定限度不僅嚴(yán)重影響作物生長(zhǎng)發(fā)育，降低其產(chǎn)量和品質(zhì)，而且能通過食物鏈富集，危害人體健康。因此，研究Cd的植物毒性機(jī)制，以及植物對(duì)Cd脅迫的應(yīng)答機(jī)制，對(duì)于提高植物對(duì)Cd的抗/耐性，改良糧食作物品質(zhì)，降低Cd從植物進(jìn)入食物鏈的危險(xiǎn)性，具有十分重要的理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義。 目前，Cd脅迫對(duì)植物生理生化影響的研究大多集中在植株水平上進(jìn)

2、行，而細(xì)胞生理生化對(duì)Cd脅迫是如何反應(yīng)這一研究領(lǐng)域的探索卻相對(duì)較少。懸浮細(xì)胞具備很好的均一性，并且對(duì)環(huán)境脅迫的反應(yīng)更為敏感和直接。 為此，本研究以耐Cd性不同的大麥基因型(萎縮不知，耐Cd基因型；東17，Cd敏感基因型)為材料，在成功建立分散均勻、穩(wěn)定的胚性懸浮細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，較為系統(tǒng)地研究了Cd脅迫對(duì)大麥細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的影響及其基因型差異；并進(jìn)一步探討了飼喂Zn、Fe、GSH和SA對(duì)大麥細(xì)胞Cd毒害的緩解效應(yīng)與基因型差異及其生

3、理生化機(jī)制。此外，我們還培育了大麥(PC1163)和小麥(PC998)懸浮細(xì)胞系，并采用24孔板培養(yǎng)方法，研究了鹽(NaCl處理)和干旱(PEG處理)脅迫對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸含量的影響，并從基因表達(dá)水平探討了大小麥耐滲透脅迫差異的機(jī)理。主要研究結(jié)果如下： 1.以直徑約2mm的幼胚為外植體，建立了萎縮不知和東17兩個(gè)大麥基因型的穩(wěn)定均質(zhì)的懸浮細(xì)胞系，初步研究了大麥懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，探討了不同水平Cd脅迫對(duì)細(xì)胞活力的影響

4、及基因型差異。結(jié)果表明，大麥懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)可以明顯分為3個(gè)階段：遲滯期(0-3d)、指數(shù)生長(zhǎng)期(4-8d)、靜止期(9-12d)，由此進(jìn)一步確定了大麥細(xì)胞的最佳繼代周期為7-8d。大麥懸浮培養(yǎng)液pH值的變化與細(xì)胞的生長(zhǎng)階段存在一定的相關(guān)性，pH值變化的基本趨勢(shì)是先迅速下降，再緩慢上升，最后稍有下降。隨著Cd處理時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的加大，大麥細(xì)胞活力逐步下降，通過細(xì)胞活力及MDA含量?jī)身?xiàng)指標(biāo)的測(cè)定比較，我們確定了Cd脅迫濃度50μM，處理時(shí)

5、間5d，作為后繼生理生化研究的試驗(yàn)處理?xiàng)l件。 2.研究了不同濃度Zn、Fe對(duì)Cd脅迫下大麥細(xì)胞活力和抗氧化酶活性的影響及基因型差異。結(jié)果表明，Cd脅迫會(huì)導(dǎo)致大麥細(xì)胞活力下降、MDA含量上升，敏感基因型東17細(xì)胞較耐性基因型萎縮不知細(xì)胞受害嚴(yán)重。50μMCd脅迫下，耐性細(xì)胞系萎縮不知的SOD、POD活性顯著增強(qiáng)，但CAT活性受到抑制。敏感細(xì)胞系東17的SOD、CAT活性在Cd處理ld后有所上升，但處理5d后，活性顯著下降；而POD

6、活性在整個(gè)處理時(shí)期內(nèi)均顯著高于對(duì)照。缺Zn處理和缺Fe處理顯著降低了Cd脅迫下大麥細(xì)胞活力，并導(dǎo)致MDA含量劇烈升高；同時(shí)也使得SOD、POD、CAT活性急劇下降。而300μMZn和500μMFe在一定程度上緩解了Cd脅迫對(duì)大麥細(xì)胞造成的氧化損傷，誘導(dǎo)大麥細(xì)胞抗氧化酶活性(SOD、POD、CAT)較單獨(dú)Cd處理上升，同時(shí)MDA含量有所下降。 3.探討了外源GSH和SA對(duì)Cd脅迫下大麥細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的影響及基因型差異。結(jié)果表明，5

7、0μMCd脅迫誘導(dǎo)耐性基因型萎縮不知大麥細(xì)胞APX、MDHAR活性顯著提高，在處理中后期GR、DHAR活性也顯著上升；而敏感基因型東17在50μMCd脅迫下僅MDHAR活性顯著增強(qiáng)，至處理中后期盡管GR活性有所上升，但APX活性顯著下降，且DHAR活性在整個(gè)處理時(shí)期內(nèi)均受到抑制。盡管50μMCd脅迫降低了兩基因型大麥懸浮細(xì)胞GSH、AsA含量，并且細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG、AsA/DHA比值亦較對(duì)照有所下降，但耐性較強(qiáng)的萎縮不知胞內(nèi)的GS

8、H、AsA含量及GSH/GSSG、AsA/DHA水平較東17高。外源GSH和SA降低了Cd脅迫對(duì)大麥細(xì)胞造成的氧化傷害，使得大麥細(xì)胞MDA含量較單獨(dú)Cd處理有所下降，而細(xì)胞活力稍有上升。外源GSH顯著提高了Cd脅迫下兩基因型大麥細(xì)胞APX、MDHAR活性及內(nèi)源GSH含量和GSH/GSSG比率；而外源添加SA顯著提高了兩個(gè)大麥細(xì)胞系GSH含量和GSH/GSSG比率，同時(shí)對(duì)萎縮不知大麥細(xì)胞SOD等抗氧化保護(hù)酶、AsA-GSH循環(huán)關(guān)鍵酶類以及

9、AsA、AsA/DHA比率也有一定的促進(jìn)作用。 4.以大麥(PC1163)和小麥(PC998)懸浮細(xì)胞系為試驗(yàn)材料，采用24孔板培養(yǎng)方法，探討了鹽和干旱脅迫對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸含量的影響，并進(jìn)一步從基因表達(dá)水平探討了大小麥耐滲透脅迫差異的機(jī)理。結(jié)果表明，大麥(PC1163)和小麥(PC998)細(xì)胞對(duì)滲透脅迫的耐性存在差異，其中大麥懸浮細(xì)胞對(duì)滲透脅迫的耐性較強(qiáng)。100mMNaCl處理24h后，小麥(PC998)懸浮細(xì)胞系

10、中的活細(xì)胞量顯著下降，而大麥細(xì)胞則無顯著變化。脯氨酸是禾本科植物細(xì)胞中重要的滲透調(diào)節(jié)劑之一，大小麥細(xì)胞中脯氨酸含量的分析結(jié)果顯示，小麥(PC998)細(xì)胞中的脯氨酸水平為大麥(PC1163)細(xì)胞的3倍。NaCl脅迫下，兩種類型細(xì)胞的脯氨酸含量均隨處理時(shí)間的增加而升高；而PEG處理后，細(xì)胞內(nèi)脯氨酸水平的增幅較小。 本試驗(yàn)以Tubulin為內(nèi)參，通過半定量RT-PCR檢測(cè)分析了滲透脅迫下脯氨酸生物合成關(guān)鍵基因(P5CS和P5CR)在轉(zhuǎn)

11、錄水平上的變化。NaCl和PEG處理下，小麥(PC998)細(xì)胞P5CS和P5CR的轉(zhuǎn)錄水平隨脅迫時(shí)間的變化趨勢(shì)與其游離脯氨酸含量測(cè)定值的變化較為一致；但在大麥(PC1163)細(xì)胞中并未得到相同的結(jié)果，NaCl和PEG處理下，大麥(PC1163)細(xì)胞中P5CS和P5CR的轉(zhuǎn)錄水平無顯著變化，但其脯氨酸含量卻隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而上升。進(jìn)一步分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大麥(PC1163)細(xì)胞中P5CS和P5CR的轉(zhuǎn)錄水平較小麥(PC998)高，而大麥(PC