水中亞硝酸鹽和氨氮對中華絨螯蟹幼體的毒性效應及維生素E的營養(yǎng)調(diào)節(jié).pdf

1、本文報道了水中亞硝酸鹽和氨氮濃度的升高對我國重要養(yǎng)殖種類中華絨螯蟹幼體的急性毒性和亞致死毒性效應，初步闡明了幼蟹對亞硝酸鹽和氨氮的解毒途徑，并探討了日糧中添加維生素E(VE)對幼蟹營養(yǎng)調(diào)節(jié)能力和抗應激能力的影響。研究結(jié)果可為水生動物毒理學和營養(yǎng)免疫學提供基礎資料，同時也對甲殼動物應激評價體系的建立提供參考依據(jù)，有助于推動甲殼動物養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。 1．中華絨螯蟹幼體對亞硝酸鹽和氨氮的半數(shù)致死濃度(LC<,50>)及解毒途徑急性

2、毒性試驗的結(jié)果表明，中華絨螯蟹幼體在亞硝酸鹽中暴露24h-、48h-、72h-和96h-的LC<,50>分別為43.87-、40.24-、38.87-、38.87-mg/l；對水中總氨氮的LC<,50>分別為251.68-、217.61-、156.05-、119.67-.mg/l，非離子氨的LC<,50>值為2.75-、2.37-、1.70-、1.31-mg/l。亞硝酸鹽和氨氮對中華絨螯蟹幼體的安全濃度分別為3.8和12.0 mg/l，

3、說明中華絨螯蟹對氨氮的耐受性較高。 分析幼蟹血淋巴對相應暴露物的累積程度可看出，血淋巴中亞硝酸鹽的累積量隨水環(huán)境中亞硝酸鹽濃度的增高而增多，且血淋巴中亞硝酸鹽濃度的升高幅度遠大于水中亞硝酸鹽濃度的升高幅度，它們之間并不呈線性遞增而是表現(xiàn)出倍數(shù)增長關系；而血淋巴中的氨氮濃度與水環(huán)境中的氨氮濃度較接近，隨環(huán)境中氨氮濃度的升高呈線性增加。表明幼蟹血淋巴更容易對亞硝酸鹽發(fā)生累積。 急性亞硝酸鹽暴露和急性氨氮暴露均可使中華絨螯蟹幼

4、體血淋巴中谷氨酸鹽、谷氨酰胺、尿素的含量以及肝胰腺中谷氨酰胺的含量顯著增加，但隨暴露時間的延長，血淋巴中谷氨酸鹽、尿素及肝胰腺中谷氨酰胺的含量不斷增加，而血淋巴中谷氨酰胺的含量不斷下降。這說明幼蟹可將體內(nèi)過多的亞硝酸鹽和氨氮部分轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺或參與鳥氨酸循環(huán)以尿素的形式排出體外。相同濃度的亞硝酸鹽使血淋巴中谷氨酸鹽和谷氨酰胺含量上升的幅度遠大于相同的氨氮暴露濃度，說明亞硝酸鹽的解毒途徑在很大程度上更傾向于轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺。此外，機體還可將

5、部分亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽。 2．亞硝酸鹽和氨氮對中華絨螯蟹幼體的急性毒性效應在96h-LC<,50>的基礎上，分別設計了對照組、10-、20-、30-、40-mg/1亞硝酸鹽暴露組以及20-、40-、60-、80-mg/1氨氮暴露組，分別在暴露的3h、6h、24h、48h取樣，探討了急性亞硝酸鹽脅迫和急性氨氮脅迫對幼蟹能量利用、免疫、滲透調(diào)節(jié)以及應激蛋白70(HSP70)表達量的影響。 研究結(jié)果表明，急性亞硝酸鹽和氨氮脅

6、迫均使幼蟹血淋巴中氧合血藍蛋白含量下降，導致機體攜氧能力降低，機體主要通過糖酵解途徑提供能量，肝糖元含量下降，血糖濃度升高，肝胰腺及血淋巴中乳酸含量不斷上升。與此同時，血淋巴中甘油三酯的含量下降，說明機體還需動用大量脂肪來滿足其本身的能量需求。此外，急性亞硝酸鹽脅迫使血糖的升高幅度及氧合血藍蛋白的下降幅度均大于急性氨氮脅迫，因而亞硝酸鹽脅迫導致組織中乳酸含量的升高幅度也相應大于氨氮脅迫。 低濃度的亞硝酸鹽暴露和氨氮暴露在短期內(nèi)可

7、使幼蟹血細胞數(shù)顯著增多，并可顯著提高肝胰腺超氧化物歧化酶(SOD)活性，表現(xiàn)出“毒物興奮效應”。隨著暴露時間延長，這種興奮效應逐漸消失，血細胞數(shù)和SOD活性均逐漸下降。高濃度的亞硝酸鹽脅迫和氨氮脅迫均使幼蟹血細胞數(shù)減少，并抑制肝胰腺SOD活性，使機體對超氧陰離子的清除能力下降，從而在一定程度上降低了機體的免疫力。肝胰腺中丙二醛(MDA)含量隨亞硝酸鹽和氨氮暴露濃度的升高而升高，且隨暴露時間的延長在組織中的累積量增大，說明亞硝酸鹽和氨氮暴

8、露使組織中脂質(zhì)過氧化程度加劇。 隨著脂質(zhì)過氧化程度加劇，細胞膜結(jié)構(gòu)將遭受一定程度的損傷，導致細胞膜的通透性改變，因而血淋巴的滲透壓及主要離子濃度也會發(fā)生相應變化。亞硝酸鹽和氨氮脅迫可使血淋巴中[Na<'+>]、[K<'+>]、[Cl<'->]、強離子差以及滲透壓下降。在亞硝酸鹽處理組中，血淋巴中Cl<'->和滲透壓對亞硝酸鹽的變化較敏感，不同暴露濃度之間差異均顯著。而在氨氮處理組中，血淋巴中Na<'+>對氨氮的變化較敏感，不同暴

9、露濃度之間差異均顯著。 環(huán)境脅迫除了可影響機體的生理生化反應外，還將在細胞水平上引發(fā)一系列變化。采用Western-blotting法研究亞硝酸脅迫對幼蟹鰓組織中HSP70表達影響的結(jié)果表明，中華絨螯蟹幼體經(jīng)10mg/1和20mg/1的亞硝酸鹽處理后，鰓組織中HSP70的表達量在應激6h后達到最大，而經(jīng)30mg/1和40mg/1的亞硝酸鹽處理后，HSP70的表達量在應激3h后達到最大。而且各濃度組所誘導的王tSP70的最大表達量

10、與水中亞硝酸鹽的濃度呈正相關。因此應激蛋白能在生物體受到嚴重危害前，作為早期的預警標志應用于機體生理狀況的評價中。 3．亞硝酸鹽和氨氮對中華絨螯蟹幼體的慢性毒性效應為了解亞硝酸鹽和氨氮的長期暴露對中華絨螯蟹幼體生長及免疫的影響，揭示亞硝酸鹽和氨氮的長期暴露對幼蟹的毒害機理，共設計了對照組、5-、10-、15-、20-mg/l亞硝鹽暴露組和10-、20-、30-、40-mg/l氨氮暴露組，探討了不同濃度的亞硝酸鹽和氨氮暴露60d對

11、中華絨螯蟹幼體生長、免疫及肝胰腺顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的影響。 結(jié)果表明，在應激的前10d，幼蟹的死亡數(shù)隨亞硝酸鹽和氨氮濃度的升高而升高，且隨應激時間的延長，其死亡數(shù)不斷增加。而且亞硝酸鹽暴露和氨氮暴露均可顯著降低幼蟹的體增重，增加飼料系數(shù)。 當水中亞硝酸鹽濃度高于5mg/l時，肝胰腺中酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(ALP)活性顯著下降；當氨氮濃度達到20rag/l以上時，肝胰腺ACP和ALP活性才顯著低于對照組。這說明

12、亞硝酸鹽對肝胰腺ACP和ALP活性的影響大于氨氮，相同濃度的亞硝酸鹽暴露對機體蛋白合成和免疫的影響程度強于氨氮暴露。 對肝胰腺超微結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果表明，幼蟹暴露于20mg/l亞硝酸鹽溶液和40mg/l氨氮溶液60d后，肝胰腺部分細胞器出現(xiàn)了空泡化，具體體現(xiàn)在核膜不完整并出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，核內(nèi)物質(zhì)外溢，細胞核空泡化；大部分線粒體內(nèi)嵴消失。因此細胞器解體而造成的細胞壞死可能是亞硝酸鹽和氨氮脅迫作用的主要靶標。 4．日糧中添加VE對

13、中華絨螯蟹營養(yǎng)調(diào)節(jié)能力和抗應激能力的影響為研究日糧中添加一定量的VE對脅迫效應的緩解作用，共設計了3種日糧，其中日糧2(VE含量為660mg/kg)和日糧3(VE含量為960mg/kg)是分別在對照組(基礎日糧，VE含量為360mg/kg)的基礎上添加了300-、600-mg/kg VE，投喂60天后，將每個實驗組的半數(shù)蟹投到10mg/l的亞硝酸鹽水體中，分別研究了3種不同日糧在亞硝酸鹽應激前后對中華絨螯蟹幼體生長、免疫、滲透調(diào)節(jié)及組織

14、中VE含量的影響。 研究結(jié)果表明，用日糧2飼喂20d后，可顯著提高中華絨螯蟹幼體的特定增長率，降低飼料系數(shù)；然而，日糧3在一定程度上卻抑制了幼體的生長，提高了飼料系數(shù)。 亞硝酸鹽應激顯著提高了肝胰腺和鰓組織中SOD活性和MDA含量以及肝胰腺中ACP活性、鰓中ALP活性，但在日糧中添加VE后可使其上升幅度減小，以日糧2的變化幅度最?。煌瑫r亞硝酸鹽應激還可顯著降低肝胰腺中ALP活性、鰓中ACP活性，但日糧中添加VE后可使其下

15、降幅度減小，以日糧3的降幅最小。亞硝酸鹽應激顯著降低了對照組中血淋巴氧合血藍蛋白濃度和三組日糧的血淋巴總蛋白濃度，而VE添加組中氧合血藍蛋白濃度在經(jīng)受亞硝酸鹽脅迫后變化不顯著。組織中VE含量隨日糧中VE添加量的增加而增加，亞硝酸鹽應激均在一定程度上消耗了組織中的VE，從而使其含量下降，日糧3中肝胰腺和鰓中VE的降幅最大。綜上所述，日糧2(VE含量為660mg/kg)對幼蟹的營養(yǎng)調(diào)節(jié)作用優(yōu)于基礎日糧(VE含量為360mg/kg)和日糧3(

16、VE含量為960mg/kg)。 5．亞硝酸鹽脅迫下中華絨螯蟹幼體對VE的最適需要量為了解機體在環(huán)境脅迫下對VE的需要量，本試驗共設計了0-、300-、1000-、2000-mg/kg VE四種日糧(分別為日糧1、日糧2、日糧3、日糧4)，研究這4種日糧對暴露在10mg/l亞硝酸鹽水體的中華絨螯蟹幼體的生長、免疫及抗應激能力的影響。 研究結(jié)果表明，除日糧4組外，其它3組亞硝酸鹽應激下幼蟹的體增重和特定生長率隨日糧中VE含量

17、的增加而顯著增加，飼料系數(shù)隨日糧中VE含量的增加而顯著下降，而日糧4組的體增重、特定生長率和飼料系數(shù)介于日糧1和日糧2之間；隨飼喂時間的延長，幼蟹的體增重相對下降，飼料系數(shù)顯著提高。而幼蟹的存活率以日糧1組最低，其次為日糧4組，日糧2和日糧3組之間無顯著差異。 幼蟹肝胰腺中抗氧化酶活性以日糧3組為最高，且隨飼喂時間的延長而顯著增加，而脂質(zhì)過氧化程度也以日糧3組為最低，隨飼喂時間的延長而顯著下降。經(jīng)空氣暴露6h后，肝胰腺中抗氧化酶

18、活性均有不同程度的下降，脂質(zhì)過氧化程度加劇，但以日糧3組的變化幅度最小。 當日糧中缺乏VE時，肝胰腺和鰓中的VE含量為100μg/kg左右。除日糧4外，組織中VE含量隨日糧中VE含量的增加而升高。幼蟹在空氣中暴露6h后，組織中VE含量顯著下降，仍以日糧3組中的組織VE含量最高，日糧4組次之，日糧1組中組織VE含量最低，各日糧組中肝胰腺和鰓中VE含量兩兩間均存在顯著差異。 因此，幼蟹在亞硝酸鹽應激下對日糧中VE的最適需求量