李屬(PRUNUS)植物自交親和性及S基因進(jìn)化機制的研究.pdf

1、本研究以中國櫻桃(Prunus pseudocerasus)、甜櫻桃(P.avium)、日本櫻花(P。speciosa)和杏(P.armeniaca)品種及部分的自交和雜交后代個體為試驗材料，在鑒定這些品種自交親和特性的基礎(chǔ)上，克隆出了花柱和花粉自交不親和性決定因子，以及部分品種的S基因型，并對中國櫻桃自交親和性和李屬植物S等位基因進(jìn)化機理展開了相關(guān)的研究，取得的主要結(jié)果如下：
　　 一、對9個中國櫻桃品種進(jìn)行了人工自花授粉試驗

2、，采取花柱固定、苯胺藍(lán)熒光染色后，用熒光顯微鏡觀察了授粉72h后花柱內(nèi)花粉管生長情況，并在果實成熟前對授粉坐果率進(jìn)行了統(tǒng)計。試驗結(jié)果表明，9個中國櫻桃品種均表現(xiàn)出了很強的自交親和性；授粉72h后，多數(shù)花粉管能夠生長至花柱的基部。這些實驗結(jié)果表明，中國櫻桃屬于配子體型自交親和性果樹。對這些中國櫻桃的倍性檢測發(fā)現(xiàn)，它們都是多倍體植株，每個植株中至少含有2個不同的S等位基因。
　　 二、采用李屬S-RNase基因特異性保守引物進(jìn)行PC

3、R和RT-PCR，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序和序列比對，在中國櫻桃的14個品種中獲得了10個不同的花柱S-RNase基因，同時鑒定了9個品種的花柱S基因型。這些S-RNase基因推導(dǎo)氨基酸序列間的同源性在69.4～84.3％之間，與其它李屬物種S-RNase基因的同源性在65.31～100％之間。種間氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，5個中國櫻桃S-RNase基因與日本櫻花等其它李屬物種S-RNase基因序列同源性高出97％，它們所含有的第一內(nèi)含子和

4、第二內(nèi)含子序列間也存在極高的相似性。采用李屬SFB基因特異性保守引物進(jìn)行RT-PCR，從7個中國櫻桃品種擴(kuò)增出4種不同的并且在花粉中特異表達(dá)的花粉SFB基因，它們推導(dǎo)氨基酸序列間的同源性在76.9～80.0％之間且與它們的S-RNase基因呈緊密連鎖關(guān)系。種間序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，中國櫻桃的SFB基因同樣與其它李屬物種SFB基因序列間存在極高相似性，中國櫻桃SFB1和梅SLF9基因以及中國櫻桃SFB5和黑刺李SFB16基因間序列同源性均高

5、出96％。
　　 三、利用甜櫻桃和中國櫻桃雜交的可親和性，通過花柱S-RNase基因和花粉SFB基因特異保守引物的PCR擴(kuò)增鑒定了雜交后代個體的S基因型，從而確定了四倍體中國櫻桃S基因在花粉粒中的分布及初步的遺傳方式。對中國櫻桃自交和雜交后代個體S基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)變異的花粉SFB基因的累積并不是造成中國櫻桃自交親和的關(guān)鍵原因，‘競爭作用’才是主導(dǎo)因素。此外，研究發(fā)現(xiàn)，同一中國櫻桃品種的單個和組對S基因在自交與雜交后代中的分布都

6、不均衡，說明不同的花粉粒對同一母本花柱的親和性大小不一致，同一花粉粒對不同母本花柱的親和性也不相同。這些結(jié)果表明中國櫻桃花粉粒與母本花柱的親和性或是花粉管在花柱中生長時受到了來自花柱或子房中調(diào)控因子的影響。
　　 四、以中國櫻桃品種存在的極高種間同源性的花柱S-RNase基因和花粉SFB基因為基礎(chǔ)，從2株中國櫻桃野生品種和2株日本櫻花品種中共克隆出了8個花柱S-RNase基因和8個花粉SFB基因及一個中國櫻桃SFB-like基因

7、，其中4個S-RNase基因和1個SFB基因與其它李屬S基因序列的同源性極高。這些同源性極高的李屬S基因序列系統(tǒng)比較的結(jié)果，進(jìn)一步支持了李屬S-RNase基因的進(jìn)化是在各物種分化之前的假說。將花柱S-RNase基因與花粉SFB基因序列的同源性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)花粉SFB基因序列多態(tài)性小于花柱S-RNase基因，且它們在各自系統(tǒng)樹中的分布也不一致，說明了花粉SFB基因比花柱S-RNase基因起源晚，在共同演化的過程中，存在獨自進(jìn)化現(xiàn)象。

8、>　　 五、以北美杏'Hercot'和中國杏‘串枝紅’為材料，依據(jù)種內(nèi)品種間的雜交可親和性，對同源性極高的S4和S24單元型中花柱和花粉S基因的功能分別進(jìn)行驗證。統(tǒng)計的坐果率和72h后花粉管在花柱中的生長狀況說明這兩個杏品種均表現(xiàn)出自交不親和性和雜交可親和性。進(jìn)一步對相互雜交后代個體的S基因型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)父本中的S24和S4單元型都不能遺傳給雜交后代，表明S4-RNase和S24-RNase分別可以拒絕接受基因型為S24和S4的花粉