miR--275及其靶基因Vg--2對(duì)長角血蜱血液消化及卵巢發(fā)育的影響.pdf

1、長角血蜱（Haemaphysalis longicornis）是一種吸血性外寄生蟲，主要寄生于哺乳動(dòng)物鳥類體表，廣泛分布于東亞、新西蘭、澳大利亞及我國多個(gè)省市，是巴貝斯蟲和泰勒蟲等多種病原的主要傳播媒介，嚴(yán)重威脅人類和動(dòng)物健康。microRNA是一類由18～25個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈小分子RNA，研究表明，miRNA在吸血性節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮重要作用，尤其是參與吸血和繁殖，因此，深入了解miRNA與長角血蜱發(fā)育繁殖相關(guān)的潛在分子機(jī)制，為

2、有效免疫防控提供一種新的方法和理論性依據(jù)。
　　本實(shí)驗(yàn)通過qPCR的方法分析了miR-275在長角血蜱不同組織及發(fā)育階段的表達(dá)水平，結(jié)果表明miR-275在長角血蜱各個(gè)組織及發(fā)育階段均有表達(dá)，且差異性顯著，表明其表達(dá)具有組織和階段特異性。在饑餓狀態(tài)下，miR-275在中腸表達(dá)量最高，分別是唾液腺和卵巢的1.91倍和1.28倍;與饑餓狀態(tài)相比，飽血狀態(tài)下miR-275在卵巢和中腸的表達(dá)量顯著升高，分別升高了2.72倍和1.67倍，而

3、在唾液腺中表達(dá)量降低了0.806倍，推測(cè)其可能與蜱蟲的卵巢發(fā)育及血液消化有關(guān)。分析長角血蜱不同發(fā)育階段miR-275的表達(dá)水平，結(jié)果表明，飽血雌性成蜱和卵的表達(dá)量顯著高于其他階段，推測(cè)miR-275在飽血成蜱及卵中發(fā)揮重要功能。
　　利用RNAhybrid軟件對(duì)miR-275靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-275在卵黃原蛋白基因(Vg-2)開放閱讀框中有2個(gè)經(jīng)典的結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組熒光信號(hào)活性為66.

4、08％，與對(duì)照組相比差異顯著，實(shí)驗(yàn)結(jié)果在體外證明miR-275的靶基因?yàn)閂g-2。
　　將miR-275抑制劑antagomir(Ant-275)和陰性對(duì)照missense(MsAnt)分別注射到饑餓雌性長角血蜱體內(nèi)，qPCR結(jié)果顯示，注射antagomir之后可顯著抑制內(nèi)源性miR-275(p＜0.05);分析各組蜱蟲的生理指標(biāo)顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組蜱蟲的卵巢發(fā)育明顯受到抑制，發(fā)育成熟的卵泡量顯著減少;飽血雌蜱產(chǎn)卵量顯著降低

5、、體重下降緩慢、產(chǎn)卵時(shí)間延長且完全干癟重量與對(duì)照組相比較重（p＜0.01）。在抑制miR-275之后，長角血蜱的卵巢發(fā)育和血液消化均出現(xiàn)異常，表明miR-275在長角血蜱卵巢發(fā)育和血液消化過程中發(fā)揮重要作用。
　　為在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證Vg-2是否為miR-275的靶基因，對(duì)長角血蜱進(jìn)行基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。將miR-275抑制劑antagomir和Vg基因抑制劑dsRNA(dsVg)共同注射到饑餓長角血蜱體內(nèi)，結(jié)果顯示，注射Ant-275/