蜱攜帶病原體多樣性及長角血蜱實驗傳播SFTSV的研究.pdf

1、蜱是一種重要的媒介昆蟲，廣泛寄生于多種脊椎動物，在吸血的過程中能獲得和傳播病原體。蜱的地理分布廣，氣候適應(yīng)性強，同時是多種病原體的傳播媒介，包括病毒（如森林腦炎病毒、克里米亞-剛果出血熱病毒、發(fā)熱伴血小板綜合征病毒等），細菌（土拉弗朗西斯菌等），立克次氏體（斑點熱立克次體、無形體等），螺旋體（伯氏疏螺旋體等），原蟲（巴貝西蟲等）以及支原體和衣原體等。近年來，我國報導(dǎo)的蜱媒病逐漸增多，嚴重危害人和動物的健康，引起了人們的廣泛關(guān)注，研究蜱攜

2、帶病原體多樣性，有助于了解我國蜱傳疾病的病原譜，對于了解我國自然疫源地疾病有著深遠的意義。
　　我們首先用16S rRNA基因文庫的方法對我國新疆維吾爾族自治區(qū)的銀盾革蜱進行了細菌性病原體的篩查。對452條16S rRNA序列經(jīng)Online RDP Classifier在Confidence value80％水平上進行分析，共發(fā)現(xiàn)50個物種，分別分布在四門中，最多的一門是變形菌門（Proteobacteria），占62.8％，然后

3、依次是擬桿菌門（Bacteroidetes），占13.5％，厚壁菌門（Firmicutes），占12.4％，放線菌門(Actinobacteria)，占11.3％。其中，我們發(fā)現(xiàn)了立克次體類微生物，并對其進行了進一步鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我們所采集的銀盾革蜱中攜帶兩種斑點熱立克次體群微生物，分別與Rickettsia raoultii和R.slovaca最為接近。據(jù)報道，R.raoultii和R.slovaca會造成人類導(dǎo)致蜱咬淋巴結(jié)病(TI

4、BOLA/DEBONEL，tick-bornelymphadenopathy/Dermacentor-bome necrosis erythema and lymphadenopathy)，這提示了該地區(qū)可能有此病的流行存在。
　　然而，16S rRNA基因文庫的方法只能篩查細菌類的病原體。對于不同類型的病原如DNA病毒、RNA病毒以及細胞結(jié)構(gòu)的病原體等，在利用目前的宏基因組學(xué)方法和技術(shù)進行篩查時，需要根據(jù)不同的病原體對樣本采用不

5、同的前期處理和測序，這就需要更多的樣本和人力物力。為此，我們建立了一種新的基于smallRNA深度測序的全面篩查病原體的方法，并對來自我國北京和上海的長角血蜱攜帶病原體的多樣性展開篩查。這種方法的理論依據(jù)是，無脊椎動物的天然抗病毒免疫機制“RNA沉默”可以產(chǎn)生小片段的病毒源性的siRNA(21-26nt)。另外，又考慮到small RNA片段可能包含RNA各種生化途徑產(chǎn)生的小片段，如rRNAs，tRNAs，snRNA，snoRNA等，因

6、此我們認為用small RNA深度測序的數(shù)據(jù)來進行多種微生物病原體的發(fā)現(xiàn)是可行的，不僅僅包括病毒，而且也包括原核生物病原體和真核生物病原體。我們利用長角血蜱的small RNA深度測序數(shù)據(jù)，對測得的序列進行了生物信息學(xué)的分析，預(yù)測了斑點熱立克次體、柯克斯氏體在蜱中的存在，并且通過實驗驗證了我們的預(yù)測。我們建立的在媒介昆蟲中用small RNA深度測序篩查病原的方法為自然疫源地新發(fā)傳染病的預(yù)警和溯源提供了一條新的行之有效的途徑。
　

7、　自2004年我國傳染病監(jiān)測工作加強以來，我國中部地區(qū)有不明原因的嚴重急性發(fā)熱性疾病零星上報?；颊咧饕R床表現(xiàn)為:流感樣癥狀、血小板減少、白細胞減少;病例呈零星的散在分布，也有少數(shù)聚集性病例。該疾病被稱為發(fā)熱伴血小板綜合征(Severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)。2011年，人們發(fā)現(xiàn)了一種布尼亞病毒科的新病毒(Severe fever with thrombocytopenia

8、syndrome virus，SFTSV)，其與SFTS的關(guān)聯(lián)與科赫法則相符，被認為是SFTS的病原體。
　　但是SFTS的臨床表現(xiàn)并不特異，雖然SFTSV可以認定為能導(dǎo)致SFTS的病原體，但其依然可能與其他傳染性病原有關(guān)，比如嗜粒細胞無形體、埃里克體等(1)，這些都是可經(jīng)蜱傳的重要病原體。因此，為進一步掌握SFTS高發(fā)地區(qū)自然疫源地疾病的基本情況，我們結(jié)合了16S rRNA文庫和small RNA高通量測序這兩種方法的理念，在方

9、法上揚長避短，用更優(yōu)化的高通量測序方法對河南省信陽地區(qū)重要媒介生物長角血蜱展開了病原體的篩查。研究發(fā)現(xiàn)，河南省信陽地區(qū)的長角血蜱中存在以下病原體:牛無形體(Anaplasma bovis)(9.03％，13/144)，中央無形體(A.centrale)(1.39％，2/144)，黑龍江立克次體（R.heilongjiangensis）(2.08％,3/144)，R.sp.LON-13(0.69％,1/144)，R.raoultii(3.

10、47％,5/144),Babesia sp.MA＃361-1(0.69％，1/144)以及SFTSV(18.75％，27/144)。其中，我們發(fā)現(xiàn)A.bovis和SFTSV的復(fù)合感染(2.08％，3/144)。同時，我們對獲得的SFTSV全序進行了系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)，蜱中的SFTSV與病人的SFTSV聚在一支，這表明了SFTSV、病人和長角血蜱存在著一定的關(guān)聯(lián)，提示了長角血蜱可能是SFTSV傳染給人的媒介。
　　(目)前，人們對于新

11、病毒SFTSV的傳播模式尚無明確的結(jié)論。有研究證實SFTSV可以通過血液的途徑實現(xiàn)人傳人的傳播，SFTSV病人的體液和排泄物分泌物也扮演者病毒傳播的潛在角色。對于SFTSV傳播循環(huán)，目前的研究尚局限于對流行區(qū)的家畜和媒介的流行病學(xué)調(diào)查。這些流行病學(xué)研究表明，長角血蜱很可能是關(guān)于SFTSV的傳播媒介，但目前還沒有足夠的證據(jù)支持。蜱和宿主在傳播循環(huán)中的地位不能僅僅依靠現(xiàn)場研究，一些假設(shè)還需要實驗證據(jù)來證實。要明確蜱是不是特定病原體的傳播媒介

12、，必須滿足以下三個條件:1，蜱從感染的宿主動物中獲得特定病原體的能力;2，特定病原體在蜱中經(jīng)期傳播的能力;3，蜱傳播特定病原體給宿主動物的能力。因此我們對長角血蜱傳播和保持SFTSV的能力進行了實驗研究。為明確長角血蜱是否為SFTSV的傳播媒介，我們在實驗室條件下對長角血蜱傳播和保持SFTSV的能力進行了研究。
　　我們用實驗室人工培育的無感染SFTSV的長角血蜱種群和從當(dāng)?shù)夭∪酥蟹蛛x出的一株SFTSV進行傳播實驗。我們采用顯微注

13、射的方法對蜱進行人工感染，利用PCR和間接免疫熒光試驗(IFA)的方法檢測蜱對SFTSV的保持能力以及體內(nèi)SFTSV對敏感動物的感染能力。實驗組和對照組分別選用40只雌性成蜱，分別將SFTSV病毒培養(yǎng)上清稀釋液和PBS通過肛門注入蜱的中腸，注射后的蜱在人工環(huán)境中養(yǎng)殖并傳代。在此期間，我們對長角血蜱保持和傳播SFTSV的能力進行了評估。
　　實驗結(jié)果表明，SFTSV進入長角血蜱體內(nèi)后，由中腸轉(zhuǎn)移到唾液腺。在蜱生長繁殖過程中，病毒也隨

14、之增殖，并且傳給下一代的卵，在隨后的幼蜱期、若蜱期和成蜱期都能檢測到病毒的存在。第二代成蜱唾液腺、卵巢和中腸中，能夠檢測到病毒的存在。血淋巴中檢測到了SFTSV的存在，這解釋了病毒在長角血蜱組織間轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。唾液中也檢測到了病毒的存在，這表明了長角血蜱將病毒傳給宿主動物的能力。我們對飼養(yǎng)蜱過程中蜱叮咬的Balb/c鼠做了檢測:顯微注射的人工感染蜱叮咬的Balb/c鼠SFTSV核酸檢測陽性，隨后的血清中也檢測到了抗SFTSVIgG的存在。

15、通過我們的研究，長角血蜱保持和傳播SFTSV的能力得到了證實，SFTSV能夠在長角血蜱中經(jīng)期和經(jīng)卵傳播，SFTSV能夠由長角血蜱蜱傳播給宿主動物。
　　綜上，一方面，我們探索了幾種不同的宏基因組學(xué)技術(shù)廣譜高效篩檢蜱媒病原體的方法，建立了一種新的基于small RNA深度測序的全譜病原篩選方法，并驗證了本方法的可行性，在長角血蜱體內(nèi)檢測到斑點熱立克次體和柯克斯氏體。同時，我們突破16S rDNA文庫法和small RNA深度測序法的

16、局限性，結(jié)合這兩種方法的思想，揚長避短，又建立了一種基于Ion PGM高通量測序平臺的方法，對蜱攜帶的病原體進行全譜篩查，在SFTS流行區(qū)河南信陽采集的長角血蜱中檢測到無形體、斑點熱立克次體、巴貝西蟲和SFTSV等病原體。另一方面，對從河南信陽長角血蜱中檢測得到的SFTSV進一步進行了基因特征分析與遺傳進化分析，證實了當(dāng)?shù)亻L角血蜱中的SFTSV與SFTS病人分離的SFTSV的同源性，這提示了長角血蜱可能是將SFTSV傳染給人的媒介。在接