‘國(guó)光’蘋果紅色芽變果實(shí)著色分子機(jī)理初步研究.pdf

1、蘋果（Malus domestica Borkh)是世界上最主要的鮮食果品之一，其果實(shí)色澤是重要的外觀品質(zhì)，直接決定其商品價(jià)值?！畤?guó)光'是20世紀(jì)80年代中國(guó)北方廣泛種植的蘋果品種之一，具有晚熟、酸甜適口及抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，近年來(lái)再次受到消費(fèi)者的青睞，但著色差一直是限制其發(fā)展的重要因素。2005年課題組在山東省五蓮縣發(fā)現(xiàn)了一株‘國(guó)光'的紅色突變，其突出的特點(diǎn)是比國(guó)光著色早，著色好，成熟時(shí)果面片紅。果皮的紅色主要由花青苷類物質(zhì)的含量和成分決

2、定的，花青苷是由一系列的酶促反應(yīng)生成的次生代謝物。前人以‘國(guó)光'為對(duì)照，從生理層面上對(duì)紅色芽變花青苷積累及合成途徑關(guān)鍵酶的活性進(jìn)行了研究。本文在此基礎(chǔ)上，比較了兩試材中花青苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平以及三個(gè)調(diào)節(jié)基因的編碼區(qū)，找出了引發(fā)紅色突變的關(guān)鍵基因；并通過(guò)對(duì)關(guān)鍵基因MdMYB1基因組和上、下游調(diào)控序列的擴(kuò)增和比對(duì)，以及MdMYB1啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)的比較，闡明了MdMYB1表達(dá)量差異的原因。主要研究結(jié)果如下：

3、　　 1.果實(shí)發(fā)育后期正常光照條件下的果實(shí)MdCHS、MdF3H、和 MdUFGT表達(dá)量逐漸上升，采收前達(dá)到最大值；MdCHI、MdDFR1及MdLDOX的表達(dá)量亦逐漸上升，但在采收前略有下降；套袋處理（盛花后30天套袋，采收前30天除袋）的果實(shí)除袋前花青苷合成結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量均很低，除袋后迅速上升；與正常光照條件下的果實(shí)相比，套袋處理明顯提高了MdDFR1，MdLDOX及 MdUFGT的表達(dá)水平，但兩不同光照處理MdCHS，MdCHI

4、和 MdF3H的表達(dá)差異不大。兩種試材相對(duì)比，不同光照處理下紅色芽變6個(gè)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)水平均不同程度地高于‘國(guó)光'，且位于合成途徑下游的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量差異更加明顯。類黃酮合成另兩條分支途徑中，黃酮醇合成酶基因MdFLS的表達(dá)水平明顯低于‘國(guó)光'，而單寧生物合成途徑中無(wú)色花色素還原酶基因MdLAR1和MdANR的表達(dá)量在兩種試材中差異不明顯，僅個(gè)別階段芽變表達(dá)量略低。
　　 2.根據(jù)MdMYB1，MdbHLH3及 MdbHLH33的

5、cDNA序列設(shè)計(jì)特異引物，分別從‘國(guó)光'及其紅色芽變中克隆出以上三個(gè)花青苷合成調(diào)節(jié)基因的編碼區(qū)并進(jìn)行測(cè)序比對(duì)。結(jié)果表明兩種試材中MdMYB1和 MdbHLH3兩種調(diào)節(jié)基因的編碼序列完全一致，編碼結(jié)構(gòu)相同的蛋白質(zhì)；MdbHLH33蛋白的結(jié)構(gòu)略有差異：氨基酸序列中第304位的氨基酸不同，‘國(guó)光'為甲硫氨酸（Met），而芽變中為蘇氨酸（Thr）。
　　 3．正常光照條件下，MdMYB1的表達(dá)量隨著果實(shí)成熟逐漸升高，后期達(dá)到最大值并略微

6、呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；套袋處理果實(shí)除袋前MdMYB1表達(dá)量很低，除袋后迅速上升。與正常光照條件下的果實(shí)相比，套袋處理明顯提高了MdMYB1的表達(dá)水平。兩種試材相對(duì)比，不同光照處理下芽變MdMYB1的表達(dá)量均明顯高于‘國(guó)光'。MdbHLH3的表達(dá)與花青苷積累相關(guān)性不明顯，MdbHLH33的表達(dá)與MdMYB1顯著相關(guān)；兩試材MdbHLH3和MdbHLH33的表達(dá)量無(wú)明顯差異。
　　 4.對(duì)‘國(guó)光'及其芽變MdMYB1基因組及上、下游序列進(jìn)行

7、克隆比對(duì)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示對(duì)應(yīng)序列的長(zhǎng)度無(wú)差異，說(shuō)明芽變MdMYB1內(nèi)含子及上、下游調(diào)節(jié)序列中無(wú)基因片段如反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子等插入或缺失；對(duì)基因片段進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，也未發(fā)現(xiàn)兩種試材中有明顯差異，說(shuō)明芽變MdMYB1未發(fā)生DNA水平上的變化。對(duì)兩種試材MdMYB1啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)紅色芽變-965～-416區(qū)域甲基化水平明顯低于‘國(guó)光'。
　　 綜上所述，紅色芽變中花青苷合成結(jié)構(gòu)基因表達(dá)水平協(xié)同上調(diào)；MdMYB1表達(dá)量