柿果實CCD1基因超表達(dá)和RNAi載體構(gòu)建及其農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化Micro-Tom番茄的研究.pdf

1、陳昕晟柿果實CCDI基因超表達(dá)和RNAi載體構(gòu)建及其農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄的研究摘要與果實品質(zhì)有重要關(guān)系的脫輔基類胡蘿卜素香氣成分形成有關(guān)的CCOs(類胡蘿卜素裂解氧化酶)主要是CCDl和CCD4分支，課題組前期研究表明柿果實中確實存在脫輔基類胡蘿卜素香氣成分，但其形成是否與CCDs相關(guān)還不確定。根據(jù)已經(jīng)克隆的DkCCDl基因，本研究構(gòu)建了含有DkCCDl基因的超表達(dá)載體和RNAi表達(dá)載體，確定了MicroTom番茄的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并以農(nóng)桿菌葉

2、盤轉(zhuǎn)化法將上述兩個載體成功導(dǎo)入番茄中。主要研究結(jié)果如下：，1、CTAB法提取‘小方柿’果肉總RNA，根據(jù)帶有不同酶切位點的引物獲得目的基因，將擴(kuò)增的目的基因序列與NCBI登錄的基因序列進(jìn)行基因序列比對和氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)基因序列相似度均超過99％，氨基酸序列相似度均為100％，由此得到用于后續(xù)實驗的目的基因；將得到的目的基因與雙元表達(dá)載體pCAMBIAl301連接，成功構(gòu)建了pCAMBIAl301一CCDl超表達(dá)載體和具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的p

3、CAMBIAl301CCDlRNAi表達(dá)載體，通過凍融法將載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHAl05，80。C保存?zhèn)溆谩?、在MicroTom番茄再生體系的基礎(chǔ)上，對載體上所攜帶的標(biāo)記基因IIygB和篩選過程中的抑菌劑特美汀(Tim)進(jìn)行壓力篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hyg的濃度越高，對外植體的分化影響越大，愈傷誘導(dǎo)、芽分化和生根篩選培養(yǎng)過程中使用的濃度分別為7mg／L、9mgIL和5mg／L；Tim對外植體的生長沒有較大的抑制作用，濃度為450mg／L時，對愈

4、傷和芽分化有小幅度影響，濃度為500mg甩時，對生根有小幅度影響，結(jié)合成本考慮，篩選培養(yǎng)過程中抑菌劑濃度均選擇400mg／L。根據(jù)以上結(jié)果確定愈傷誘導(dǎo)選擇培養(yǎng)基為MS2mg幾6BA02m嘰NAA7mgmHyg400mg／LTim07％瓊脂3％蔗糖，芽分化選擇培養(yǎng)基為MS1mg／LZT9mg／LHyg400mg／LTim07％瓊脂3％蔗糖，生根選擇培養(yǎng)基為MS01mg／LNAA5mg／LHyg400mgmTim07％瓊脂3％蔗糖。3、根據(jù)