MAPK在ABA誘導(dǎo)的玉米葉片抗氧化防護(hù)中的作用.pdf

1、植物激素脫落酸(abscisic acid，ABA)不僅在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中而且還在植物對(duì)各種環(huán)境脅迫的反應(yīng)中起重要作用。ABA可以引起一氧化氮(nitric oxide，NO)和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，誘導(dǎo)抗氧化基因的表達(dá)，提高植物抗氧化防護(hù)能力。ABA、NO、ROS都可以活化促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)，活化的M

2、APK調(diào)節(jié)植物對(duì)多種脅迫反應(yīng)的生理過(guò)程。ROS在ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)中起重要作用。然而，有關(guān)ABA誘導(dǎo)抗氧化防護(hù)的詳細(xì)機(jī)制仍有待闡明。 本研究以玉米葉片為材料，研究了在ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)過(guò)程中MAPK的作用以及H<,2>O<,2>、MAPK與NO之間的關(guān)系。主要的研究結(jié)果如下： 利用髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)作為底物，采用凝膠激酶分析方法研究了ABA處理后玉米葉

3、片MAPK的活化情況。100μM ABA處理明顯活化一個(gè)46 kDa的MBP激酶，以ABA缺失突變體vp5為材料，用10％PEG處理2 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在野生型中MBP激酶活性明顯增加，而突變體中卻增加很少，表明水分脅迫誘導(dǎo)的內(nèi)源ABA積累能夠活化MBP激酶。用酪氨酸磷酸化單克隆抗體4G10進(jìn)行免疫沉淀凝膠激酶分析結(jié)果顯示，ABA處理的玉米葉片蛋白質(zhì)與對(duì)照的相比具有很高的酪氨酸磷酸化的MBP激酶活性。用兩種專一性的MAPKK抑制劑PD980

4、59和U0126預(yù)處理都抑制了ABA誘導(dǎo)的MBP激酶活性。這些結(jié)果表明ABA活化的46 kDa的MBP激酶是一種MAPK。而兩種專一性的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase，PTP)抑制劑，PAO(phenylarsine oxide)和3，4DP(Methyl-3，4-dephostatin)預(yù)處理并不影響ABA誘導(dǎo)的MBP激酶活性。 ABA處理不僅誘導(dǎo)幾種抗氧化防護(hù)基因轉(zhuǎn)錄水平

5、增加，如CAT1(編碼CAT1同工酶)、cAPX(編碼細(xì)胞質(zhì)APX同工酶)與GR1(編碼質(zhì)體GR同工酶)，還誘導(dǎo)過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性的增加。兩種專一性的MAPKK抑制劑PD98059和U0126預(yù)處理明顯抑制了

6、ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)基因表達(dá)和酶活性增加，但是兩種專一性的PTP抑制劑PAO和3，4DP預(yù)處理并不影響ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)基因表達(dá)與酶活性。表明是MAPK而不是PTP參與ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)。 H<,2>O<,2>抑制劑和清除劑DPI(diphenyleneiodonium)、咪唑、DMTU(dimethythiourea)和Tiron預(yù)處理結(jié)果顯示ROS的抑制劑或清除劑幾乎完全抑制了ABA誘導(dǎo)的MAPK

7、的活性、抗氧化防護(hù)基因表達(dá)及酶活性，說(shuō)明H<,2>O<,2>參與ABA誘導(dǎo)的MAPK的活化和抗氧化防護(hù)基因表達(dá)及酶活性的增加。H<,2>O<,2>處理也誘導(dǎo)MAPK活化，CATl、cAPX、GRl表達(dá)和CAT、APX、GR、SOD活性增加。PD98059和UO126預(yù)處理抑制了H<,2>0<,2>誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)基因表達(dá)和酶活性，而PAO和3，4DP預(yù)處理卻沒(méi)有影響。 分別用DAB(3,3-diaminobenzidine

8、)染色的組織化學(xué)、分光光度法和CeCl<,3>染色的細(xì)胞化學(xué)三種方法檢測(cè)了MAPK或PTP對(duì)ABA誘導(dǎo)的H<,2>0<,2>產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯不MAPKK抑制劑PD98059和UO126預(yù)處理明顯抑制了ABA誘導(dǎo)的H<,2>O<,2>的積累，但PTP抑制劑PAO和3,4DP只是輕微的抑制了H<,2>0<,2>的積累。表明MAPK參與ABA誘導(dǎo)的H<,2>O<,2>的產(chǎn)生，而PTP只輕微影響H<,2>0<,2>的積累。MAPKK抑制劑時(shí)間

9、進(jìn)程實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯不MAPKK抑制劑PD98059和U0126預(yù)處理在1 h內(nèi)幾乎對(duì)ABA誘導(dǎo)的H<,2>O<,2>積累沒(méi)有影響，但在2 h后明顯抑制了H<,2>0<,2>的積累，表明ABA誘導(dǎo)的最初的H<,2>O<,2>積累不依賴MAPK的活化。 用NO特異的熒光染料DAF-2DA對(duì)小塊葉片進(jìn)行染色，并用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy,CLSM)觀察熒光變化。ABA和H<,

10、2>0<,2>處理都迅速誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生，ABA處理時(shí)NO在2 h達(dá)到最大并一直持續(xù)到4 h，6 h后開(kāi)始減弱。而H<,2>0<,2>處理時(shí)最大值出現(xiàn)在1 h，4 h后開(kāi)始減弱。 NO清除劑cPTIO(2-(4-carboxyphenyl)-4，4，5，5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide)和NOS抑制劑<,L>-NAME(N<'c>-nitro-L-Arg methyl ester)預(yù)

11、處理部分抑制了ABA和H<,2>0<,2>誘導(dǎo)的MAPK的活化、抗氧化防護(hù)基因表達(dá)和酶活性增加，表明NO參與ABA和H<,2>0<,2>誘導(dǎo)的玉米葉片MAPK的活化、抗氧化防護(hù)基因的表達(dá)和酶活性增加。MAPKK抑制劑幾乎完全抑制了NO誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)基因表達(dá)和酶活性的增加，說(shuō)明在玉米葉片中NO誘導(dǎo)的MAPK活化參與NO誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)系統(tǒng)。H<,2>0<,2>抑制劑和清除劑DPI和DMTU預(yù)處理并不影響NO誘導(dǎo)的MAPK的活化、抗氧化防

12、護(hù)酶轉(zhuǎn)錄和活性增加，說(shuō)明H<,2>0<,2>不參與NO誘導(dǎo)的MAPK活化和抗氧化防護(hù)系統(tǒng)。 用CeCl<,3>染色后透射電鏡觀察玉米葉片葉肉細(xì)胞，結(jié)果顯示用NO供體SNP處理后的6 h內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)H<,2>0<,2>；而且cPTIO和<,L>-NAME預(yù)處理也不影響ABA誘導(dǎo)的H<,2>0<,2>積累。另一方面，DPI和DMTU預(yù)處理幾乎完全抑制了ABA誘導(dǎo)的NO的產(chǎn)生，而PD98059和U0126預(yù)處理不影響ABA誘導(dǎo)的NO的產(chǎn)生