環(huán)丙沙星膠體金試紙條的制備.pdf

1、環(huán)丙沙星(Ciproflxoacin,CIP)作為第三代的氟喹諾酮類藥物，具有廣泛的抗菌活性，被普遍地應(yīng)用在人類疾病的治療中。由于交叉抗性等原因，環(huán)丙沙星在動(dòng)物可食用組織中的殘留不僅嚴(yán)重威脅了公共衛(wèi)生安全，成為重大的食品安全隱患，還進(jìn)一步影響了農(nóng)產(chǎn)品的對(duì)外出口貿(mào)易。目前，CIP被我國(guó)被列為禁用漁藥，其在美國(guó)、歐盟等國(guó)家或地區(qū)也被列為重點(diǎn)監(jiān)控的對(duì)象。因此建立快速、靈敏的環(huán)丙沙星殘留免疫學(xué)檢測(cè)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和技術(shù)價(jià)值。膠體金試紙條作

2、為一種快速、靈敏、不需要任何儀器的檢測(cè)技術(shù)可作為環(huán)丙沙星殘留現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的重要手段。本實(shí)驗(yàn)通過合成環(huán)丙沙星的人工抗原，免疫Balb/c小白鼠采集免疫鼠脾臟細(xì)胞，采用雜交瘤技術(shù)制備了環(huán)丙沙星的單克隆抗體，并利用得到的單克隆抗體制備了環(huán)丙沙星的膠體金試紙條。
　　 采用改進(jìn)的碳二亞胺法，在4種不同pH值條件下，制備了4種不同偶聯(lián)比率的環(huán)丙沙星與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)物，通過紫外掃描、SDS-PAGE、TNBS和氨基酸分析等方法對(duì)環(huán)丙

3、沙星人工免疫原CIP-BSA進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：在pH為4.3條件下，CIP-BSA-2的偶聯(lián)比最高，可達(dá)到34:1，利用TNBS測(cè)定CIP-BSA-2的偶聯(lián)比為33∶1。在同一條件下，制備得到的CIP-OVA的偶聯(lián)比率為12∶1。氨基酸分析顯示CIP-BSA-2消耗了BSA表面的ASP、GLU、LEU、LYS這四種氨基酸。質(zhì)譜分析表明CIP-BSA-2的指紋肽段質(zhì)譜出現(xiàn)了BSA的指紋特征肽段，證明了偶聯(lián)的成功。利用CIP-BSA-2免

4、疫小鼠，得到的血清效價(jià)均為105以上，表明制備得到的CIP-BSA-2偶聯(lián)物可以用于環(huán)丙沙星人工抗原的制備。
　　 將CIP-BSA-2分別免疫5只小白鼠，加強(qiáng)免疫后獲得多抗血清，采用CIP-OVA為包被原進(jìn)行血清效價(jià)測(cè)定，結(jié)果表明各血清效價(jià)均高于105。選取血清效價(jià)最高的小鼠用于細(xì)胞融合。采用雜交瘤技術(shù)將脾臟與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。然后運(yùn)用間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行陽性克隆的篩選，利用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆

5、，并從中篩選出2株穩(wěn)定的分泌抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別為JY-1和JY-2。最后通過腹水大量制備抗體，采用辛酸-飽和硫酸銨法純化獲得單克隆抗體。對(duì)單克隆抗體的特性鑒定結(jié)果表明：兩抗體均為IgG2a型單抗，抗體的蛋白濃度分別為1.348mg/mL、1.583mg/mL。兩抗體的親和力均能達(dá)到109以上，屬于高親和力的抗體。利用JY-1建立了ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其IC50可達(dá)9.83ng/mL，表明抗體靈敏度高，同時(shí)JY-1抗體的特異性良好，

6、僅與恩諾沙星存在交叉反應(yīng)，與其他待測(cè)藥物之前均不發(fā)生交叉反應(yīng)，選取JY-1用于膠體金試紙條的研制。
　　 通過檸檬酸鈉還原法制備得到了膠體金顆粒，通過紫外掃描和電鏡掃描對(duì)制備得到的膠體金進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明膠體金的粒徑大約在25nm左右。利用膠體金標(biāo)記JY-1抗體，制備得到膠體金試紙條。對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行鑒定，試紙條的最低檢測(cè)限為10ng/mL,僅與恩諾沙星存在交叉反應(yīng)。樣品在4℃的條件下，可以保藏6個(gè)月。
　　 綜上，本實(shí)驗(yàn)制