魔芋軟腐病菌致病性測定及遺傳多樣性分析.pdf

1、本研究從湖北魔芋主要產(chǎn)區(qū)采集魔芋軟腐病害標(biāo)本，對(duì)從中分離得到的59個(gè)魔芋軟腐菌株進(jìn)行致病性測定和生理生化特性比較，在此基礎(chǔ)上，采用相關(guān)分子生物學(xué)方法從分子水平上對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，并對(duì)魔芋軟腐菌群體遺傳多樣性進(jìn)行了分析。取得的主要結(jié)果如下：
　　 1．魔芋軟腐菌致病力分化：對(duì)分離保存的59個(gè)魔芋軟腐菌保存菌株，經(jīng)活化培養(yǎng)后，制備成濃度約為108cfu/mL的菌懸液，并將健康魔芋球莖切成直徑1.5cm的打孔器切成圓球塊，并將球塊置于滅

2、菌培養(yǎng)皿，每皿3個(gè)，每個(gè)處理設(shè)三個(gè)重復(fù)。用移液槍吸取100ul菌懸液分別進(jìn)行人工穿刺接種，并用無菌水為對(duì)照，置于28℃保濕培養(yǎng)，接種5天后觀察并記錄魔芋球塊腐爛情況。結(jié)果表明，供試的59個(gè)菌株致病力存在明顯分化，根據(jù)其接種后腐爛程度，分為強(qiáng)、較強(qiáng)、中、弱四種類型，其中致病力強(qiáng)的有11株，約占18.6％；致病力較強(qiáng)的有14株，約占23.7％；致病力中等的有11株，約占18.6％；致病力弱的有24株，約占39.1％。進(jìn)一步分析不同地理來源菌

3、株致病力比較顯示，不同地區(qū)魔芋軟腐病菌株的致病力存在明顯差異，同一地區(qū)菌株間致病力也不盡相同，由此說明引起湖北省魔芋軟腐病的病原菌致病力的存在明顯的分化現(xiàn)象且這種分化與地理位置沒有直接的相關(guān)性。
　　 2．魔芋軟腐菌相關(guān)生理生化特性的研究：對(duì)59個(gè)菌株進(jìn)行革蘭氏染色反應(yīng)及氫氧化鉀溶解試驗(yàn)，結(jié)果顯示供試菌株均為革蘭氏陰性菌。進(jìn)一步對(duì)菌株進(jìn)行耐鹽性試驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)、丙二酸鈉的利用、檸檬酸鹽的利用、H2S試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、明膠液

4、化試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、過氧化氫酶測定，37℃生長試驗(yàn)、酪素水解和酪氨酸水解等相關(guān)生理生化鑒別試驗(yàn)，結(jié)果表明，供試菌株對(duì)應(yīng)的生理生化反應(yīng)結(jié)果各不相同。參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版的主要生理生化鑒別性狀，可將供試的59個(gè)菌株劃分為兩個(gè)不同的亞種，其中胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種Erwinia carotovora subsp．carotovora（Ecc）有52株，占總數(shù)的88.1％；菊歐文氏亞種Erwinia chrysanther

5、ni（Ech）有7株，占總數(shù)的11.9％。這一結(jié)果與已報(bào)道的魔芋軟腐病的病原菌一致。研究說明，引起湖北省魔芋軟腐病的病原菌主要是胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種；但也存在一定比例的菊歐文氏亞種，對(duì)此應(yīng)根據(jù)軟腐病菌種群變化控制病害的發(fā)展。
　　 3．魔芋軟腐菌的ITS分子鑒定：本研究利用ITS-PCR擴(kuò)增對(duì)供試的59株軟腐菌株進(jìn)行分子水平鑒定，同時(shí)根據(jù)其擴(kuò)增的帶型將其分為2個(gè)組群，即：胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種Erwinia

6、 carotovora subsp．carotovora（Ecc）組群和胡蘿卜軟腐歐文氏菌菊歐文氏亞種Erwinia chrysanthemi（Ech）組群。這樣不僅從分子水平上對(duì)分離純化的軟腐菌株進(jìn)行進(jìn)一步的確定，還能與生理生化鑒定結(jié)果相互印證；
　　 4．魔芋軟腐菌遺傳多樣性分析：以細(xì)菌通用引物BOX和J3為通用引物進(jìn)行Rep-PCR擴(kuò)增，對(duì)59個(gè)菌株進(jìn)行DNA指紋圖譜分析，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)ITS-PCR鑒定的2個(gè)組群之間在遺傳上

7、有明顯差異。雖同屬于Ecc或Ech種群，但不同菌株帶型上卻表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性，說明各菌株在遺傳水平上有明顯的差異，也進(jìn)一步表明湖北省引起魔芋軟腐病的種群存在豐富的遺傳多樣性。
　　 從Rep-PCR指紋聚類圖中可以看出，在連鎖距離為0.5時(shí)，可以將供試的59個(gè)魔芋軟腐菌株分為2個(gè)大的類群。從聚類圖可以看出，每個(gè)類群都含有致病力不同的菌株。類群Ⅰ中的包含兩個(gè)菌株，但二者的致病力卻不同，SS4菌株屬于致病力強(qiáng)的菌株，而WH2則屬于致