缺鐵脅迫對海豚鏈球菌生長的影響及鐵轉運蛋白基因(ftsABCD)的克隆與表達.pdf

1、海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)是一類重要的魚類病原菌，由該菌引起的魚類海豚鏈球菌病對當今世界的水產養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失。為了能有效的控制海豚鏈球菌病，需要對海豚鏈球菌毒力因子進行深入研究，尋找有效的抗原。鐵元素是一種生命必須的營養(yǎng)元素，眾多研究表明鐵元素作為一種重要的環(huán)境信號因子影響著細菌相關毒力基因的表達，另外，負責鐵轉運的復合體屬于ABC轉運體家族，該轉運體上的鐵元素受體結合蛋白具有一定的抗原性，能作為亞

2、單位疫苗的候選者之一?；谏鲜鲈颍疚倪x擇對海豚鏈球菌進行鐵脅迫以及鐵轉運基因的研究，希望能初步揭示鐵元素對海豚鏈球菌的重要作用，以及通過分子生物學方法找到海豚鏈球菌鐵轉運體并對受體蛋白的抗原性進行驗證，為亞單位疫苗的研制打下基礎。
　　 本研究使用次氮基三乙酸鈉鹽(Nitrilotriacetic acid trisodium salt，NTA)作為鐵螯合劑添加到腦心浸液培養(yǎng)基中人為制造缺鐵培養(yǎng)環(huán)境，觀察海豚鏈球菌的生長情況

3、。結果表明：加入終濃度為5mMNTA能夠延緩海豚鏈球菌HD-1菌株對數生長期時間6hr，且靜止期細菌密度是0.67，要顯著小于對照組0.77，且革蘭氏染色發(fā)現細菌形成長鏈狀；加入終濃度為15mMNTA則完全抑制海豚鏈球菌HD-1生長，再加入100μM血紅蛋白或者100mM氯化鐵則細菌恢復生長。進一步分析不同條件下生長的海豚鏈球菌細胞組分(SDS-PAGE電泳分析)，發(fā)現對照組與5mMNTA處理組相比，其全菌可溶蛋白、全菌不可溶蛋白、原生

4、質體破碎蛋白、胞壁蛋白、原生質體不可溶蛋白、原生質體可溶蛋白等成分均有差異。使用CAS檢測法未能檢測出海豚鏈球菌HD-1產生siderophore蛋白。此結果表明海豚鏈球菌并不是通過分泌siderophore來攝取鐵源，而是另有途徑。
　　 在對缺鐵脅迫培養(yǎng)條件下海豚鏈球菌的各種表觀特征進行了初步研究后，本研究利用海豚鏈球菌ATCC9117菌株盲測序列數據庫，與從NCBI中獲得的釀膿鏈球菌FtsABCD鐵轉運蛋白序列進行tbla

5、stn，找到同源性較高的海豚鏈球菌相關基因，并命名為海豚鏈球菌ftsABCD。設計特異性引物擴增基因全長后發(fā)現fsA基因全長783bp，編碼260個氨基酸；ftsB基因全長為927bp，編碼308個氨基酸；ftsC基因全長為1,029bp，編碼342個氨基酸；ftsD基因全長為999bp，編碼332個氨基酸。經過生物信息學分析預測海豚鏈球菌FtsABCD為一個ABC轉運體(ABC transporter)，其中FtsA基因為ATP水解酶

6、，FtsB為底物結合蛋白，FtsC與FtsD均為通透酶。
　　 通過克隆引入了BamHI、XhoI雙酶切位點的ftsB成熟肽序列，構建了原核表達質粒，然后將質粒轉入大腸桿菌BL21進行FtsB重組蛋白的表達。通過優(yōu)化溫度、時間與誘導劑IPTG濃度，最終確定了重組蛋白表達的最佳條件。FtsB重組蛋白分子量為49.6kDa，由于其帶有組氨酸標簽，因此用鎳柱對混合蛋白進行純化，然后對純化的重組蛋白進行脫鹽，冷凍干燥濃縮。
　　

7、 將海豚鏈球菌HD-1通過腹腔注射到小鼠體內，進行人工感染，在感染后第10天取感染小鼠血清作為一抗，堿性磷酸酶標記的馬抗鼠抗體為二抗，對電轉到硝酸纖維素膜上的FtsB重組蛋白進行western blot檢測。結果發(fā)現，一抗能特異性的檢測到FtsB重組蛋白。這表明海豚鏈球菌HD-1在感染小鼠的過程中，ftsB基因轉錄并表達，且表達產物FtsB蛋白能被小鼠免疫系統識別為有效抗原并產生了相應的抗體。因此，FtsB能夠作為亞單位疫苗有效抗原的候