CIAV M突變株致病性試驗(yàn)及其在DF-1上生長適應(yīng)性的研究.pdf

1、雞傳染性貧血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)為雞傳染性貧血病(Chicken infectious anemia,CIA)的病原,屬圓環(huán)病毒科(Circoviridae),為單股、負(fù)義、共價(jià)結(jié)合的環(huán)狀DNA。CIAV基因組只產(chǎn)生一個(gè)具有多順反子特性的轉(zhuǎn)錄子。轉(zhuǎn)錄子上有三個(gè)AUG密碼子,使其內(nèi)部形成三個(gè)開放閱讀框架(Open reading frames,ORFs),其中ORF3(366bp

2、)位于OFR2(651bp)內(nèi),ORF2與ORF1(1350bp)部分重疊。ORFs分別編碼VP3(13kD)、VP2(24kD)和VP1(52kD)三種病毒蛋白。VP1為結(jié)構(gòu)蛋白,是中和抗原位點(diǎn)的組成部分；VP2為VP1的伴侶蛋白或骨架蛋白,與VP1在宿主細(xì)胞內(nèi)共同誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體；VP3是CIAV的主要致病性蛋白,可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。北京市農(nóng)林科學(xué)院高新技術(shù)實(shí)驗(yàn)室夏永恒等人采用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)使編碼CIAV VP3的起始密碼子后移

3、了39位,造成VP3的不完全表達(dá),成功構(gòu)建了pTCAVm陽性克隆株并初次獲得了感染性克隆。本試驗(yàn)將從重組陽性克隆株開始,繼續(xù)研究CIAV M突變體的致病性和其對DF-1細(xì)胞系的嗜性,為尋找更好的研制CIA減毒活疫苗的方案奠定基礎(chǔ)。
　　 本試驗(yàn)選取保存于-80℃的pTCAVm陽性克隆株,按照夏永恒等人將突變株體外環(huán)化的試驗(yàn)方法,重新復(fù)壯pTCAVm重組菌株,提取重組質(zhì)粒,酶切鑒定后,使CIAV突變基因自身環(huán)化。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法,

4、將自身環(huán)化突變株轉(zhuǎn)染到MDCC-MSB1宿主細(xì)胞內(nèi),并采用IFA及RT-PCR方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制情況的檢測及CIAV序列測定,試驗(yàn)結(jié)果證明本試驗(yàn)同樣獲得了具有感染性的突變株-CIAV M突變株。用人工腹腔注射方法,將CIAVM突變株毒液接種于1日齡SPF雞,并動(dòng)態(tài)追蹤C(jī)IAVM突變株在SPF雞體內(nèi)的致病性及在SPF雞體內(nèi)傳代一次后對宿主細(xì)胞的致病性。用IFA方法,測得的CIAV M突變株的TCID50值為104.5／mL；通過臨

5、床剖檢變化及病理切片方法觀察到:7、14、21日齡時(shí),CIAV M突變株能夠引起SPF雞增重緩慢,胸腺等免疫器官內(nèi)T淋巴細(xì)胞消失、組織萎縮,雞腿骨骨髓顏色變?yōu)辄S粉色,紅細(xì)胞容積值顯著下降等CIA的特征性病變；體內(nèi)CIAV抗體水平檢測結(jié)果顯示:抗體水平表現(xiàn)為弱陽性,提示CIAV M突變株具有抗原性；采用流式細(xì)胞術(shù)測定感染的宿主細(xì)胞生長周期及細(xì)胞凋亡情況,試驗(yàn)結(jié)果顯示:回歸動(dòng)物試驗(yàn)后的CIAV M突變株對MDCC-MSB1宿主細(xì)胞周期無明顯

6、阻滯作用,但其具有致宿主細(xì)胞凋亡作用。通過與CUX-1標(biāo)準(zhǔn)毒株的同行比較,整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果顯示:CIAV M突變株具有感染性,但其致病性明顯減弱。
　　 CIAV在MDCC-MSB1宿主細(xì)胞的病毒滴度較低,不利于CIAV的疫苗生產(chǎn),因此本試驗(yàn)還試探性的將CIAV M突變株接種于DF-1細(xì)胞系中,為CIAV M突變株尋找一種新的生長細(xì)胞系。將CIAV M突變株接種于DF-1細(xì)胞系,經(jīng)過5-7天的培養(yǎng),六個(gè)重復(fù)組沒有全部出現(xiàn)纖維細(xì)胞拉網(wǎng)

7、、變圓等細(xì)胞病變；再次傳代時(shí),采用盲傳方法,接種毒液為上一代細(xì)胞反復(fù)凍融獲得的或直接從細(xì)胞板刮取的,經(jīng)過5—7天的培養(yǎng),六個(gè)重復(fù)組仍然沒有全部出現(xiàn)細(xì)胞病變。CIAV M突變株通過接種于DF-1細(xì)胞系,傳代15次,用PCR方法檢測每代收取的細(xì)胞液,并利用IFA和RT-PCR方法驗(yàn)證PCR檢測結(jié)果為陽性的樣品,但后兩種方法均未檢測出陽性樣品中的CIAV。根據(jù)整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果推斷:CIAV M突變株不能在DF-1上適應(yīng)性生長,其可能不具有特殊的D