甘藍(lán)細(xì)胞質(zhì)雄性不育性對核背景的響應(yīng)研究.pdf

1、結(jié)球甘藍(lán)(Brassica oleracea L.var.capitata L.)雜交優(yōu)勢明顯,利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育系對甘藍(lán)等葉類蔬菜進(jìn)行育種具有獨(dú)特的優(yōu)勢。但甘藍(lán)中尚未發(fā)現(xiàn)天然細(xì)胞質(zhì)雄性不育系,生產(chǎn)上多通過轉(zhuǎn)育外源不育細(xì)胞質(zhì)獲得甘藍(lán)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系,研究甘藍(lán)細(xì)胞質(zhì)雄性不育性對核背景的響應(yīng)特性,探尋不同細(xì)胞質(zhì)不育類型其雄性不育性對核背景的響應(yīng)特性,對豐富和完善細(xì)胞質(zhì)雄性不育理論和確定選育方向,減少轉(zhuǎn)育工作量有重要意義。
　　 本文

2、以回交轉(zhuǎn)育獲得的多組同質(zhì)異核細(xì)胞質(zhì)雄性不育系為材料,首先利用各類細(xì)胞質(zhì)雄性不育特異的基因鑒定引進(jìn)不育材料的類型,然后觀察各類細(xì)胞質(zhì)雄性不育花器官形態(tài)對核背景的響應(yīng),而后再對其中三份材料進(jìn)行多代連續(xù)回交轉(zhuǎn)育,獲得三組穩(wěn)定的同質(zhì)異核雄性不育系。通過石碚切片觀察研究了三種不育細(xì)胞質(zhì)花粉敗育特征對不同核背景的響應(yīng),并利用半定量RT-PCR研究了線粒體上相關(guān)基因和花形態(tài)建成相關(guān)基因在花蕾發(fā)育不同階段的表達(dá)情況；同時(shí)利用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析了三

3、種不育細(xì)胞質(zhì)線粒體基因組結(jié)構(gòu)在不同核背景下的變異情況；最后利用聚丙稀酰胺凝膠電泳分析不同核背景ATP、POD同工酶,從同工酶角度研究不同核背景的雄性不育系代謝差異,及細(xì)胞質(zhì)對核基因的反向調(diào)控。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)國內(nèi)目前對甘藍(lán)上應(yīng)用細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型缺乏分類鑒定,對各種不育細(xì)胞質(zhì)類型的應(yīng)用情況尚不明確,不育細(xì)胞質(zhì)類型較為單一。本研究對從國內(nèi)外多家科研機(jī)構(gòu)引進(jìn)的15份細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料進(jìn)行鑒定,僅發(fā)現(xiàn)1份屬于Nap型細(xì)

4、胞質(zhì)不育系,其余14份材料均屬于Ogu胞質(zhì)不育類型。
　　 (2)Nap型細(xì)胞質(zhì)不育材料和兩份Ogu細(xì)胞質(zhì)不育材料花器官形態(tài)具有較大差異。Nap型細(xì)胞質(zhì)不育材料花瓣呈喇叭狀,雄蕊短小退化,花藥形態(tài)多樣,蜜腺退化。第一組Ogu細(xì)胞質(zhì)不育材料花瓣皺縮,雄蕊心皮化,蜜腺退化；第二組Ogu不育花瓣較正常,雄蕊部分退化。Nap型花器官形態(tài)對不同核背景的響應(yīng)表現(xiàn)3種類型,第1類與原材料相近或呈負(fù)響應(yīng),第2類表現(xiàn)為正響應(yīng),第3類花器官不同部位

5、響應(yīng)不一,呈現(xiàn)正或負(fù)響應(yīng)。Ogu型花器官形態(tài)對核背景的響應(yīng)主要表現(xiàn)為不變化或較弱的正響應(yīng)。同一自交系對不同來源的不育材料影響的穩(wěn)定性,因自交系不同而異,對于自交系K1、N4,不同來源胞質(zhì)材料對其響應(yīng)趨于一致,對自交系37、F1、G7的響應(yīng),在不同來源胞質(zhì)材料間存在差異。
　　 (3)對Nap型胞質(zhì)和Ogu型細(xì)胞質(zhì)不育材料花蕾細(xì)胞學(xué)形態(tài)的研究表明,花藥以及其中花粉的發(fā)育情況受到核背景的影響。Nap型細(xì)胞質(zhì)不育系在不同核背景下敗育類

6、型分為無花粉囊分化型和有花粉囊分化型,有花粉囊分化的類型中有部分材料在四分體時(shí)期花粉停止發(fā)育,還有個(gè)別不育材料中四分體可以分離出小孢子,屬于花藥不開裂導(dǎo)致的雄性不育。第一組Ogu型不育材料花藥有心皮化趨勢,但是不同核背景下敗育特征仍有較大差異,花粉囊分化的情況在不同核背景下表現(xiàn)很不一致。并且,在該組材料普遍雄蕊心皮化的情況下,編號為95材料仍具有較為正常的花藥發(fā)育。第二組Ogu型不育系敗育時(shí)期比較穩(wěn)定,都集中于四分體時(shí)期,而花粉囊分化和

7、絨氈層的發(fā)育異常方面,在不同核背景下略有差異。
　　 (4)通過對線粒體雄性不育相關(guān)候選基因在花蕾發(fā)育不同階段和不同轉(zhuǎn)育核背景下表達(dá)的研究,發(fā)現(xiàn)Nap型細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料中orf222,cox1,atp63個(gè)基因的變化趨勢基本一致。cox1,atp6以及不育特異基因orf222均受到核背景的影響,在小中大花蕾中表達(dá)的規(guī)律,三個(gè)基因在不同核背景中表現(xiàn)不同,分為前期表達(dá)量高后期降低和發(fā)育不同階段表達(dá)一致兩種類型。這與材料敗育特征表現(xiàn)

8、有相關(guān)性。orf222,cox1,atp6表達(dá)量前期高后期降低的不育材料表現(xiàn)為無花粉囊型敗育；而三個(gè)基因在花蕾發(fā)育過程中表達(dá)量穩(wěn)定的不育材料表現(xiàn)為有花粉囊分化的敗育類型。atpA、atp9在不同大小花蕾中和不同核背景下表達(dá)量無顯著差異,即不受核背景的影響。
　　 Ogu型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系相關(guān)不育基因的表達(dá)則與Nap存在差異,且兩類Ogu不育之間也不一致。79＃來源的不育胞質(zhì)中orf138在不同核背景下表達(dá)存在一定的差異,cox1

9、,atp6 atpA、atp9的表達(dá)則不受花蕾發(fā)育階段和核背景的影響。
　　 對于99＃來源的第二組Ogu胞質(zhì),在orf138、cox1,atp6 atpA,atp95個(gè)線粒體基因的表達(dá)無明顯差異,其表達(dá)既不受核背景影響,也不隨發(fā)育階段改變而發(fā)生變化。
　　 (5)對與花形態(tài)建成相關(guān)的AP3、PI、AG基因表達(dá)分析,表明 AP3、AG在Nap型和Ogu型細(xì)胞質(zhì)不育材料中的表達(dá)均表現(xiàn)為不受核背景的影響,并且在花蕾發(fā)育的三個(gè)

10、階段表達(dá)量保持穩(wěn)定。但是PI基因在同質(zhì)異核的不育材料間其表達(dá)量表現(xiàn)出了顯著變化,推測PI在控制雄性不育系花器官形態(tài)發(fā)育上有重要作用。
　　 (6)經(jīng)XhoⅠ、PstⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ四種限制性內(nèi)切酶對三組不育材料線粒體基因組進(jìn)行酶切后發(fā)現(xiàn),13份Nap型細(xì)胞質(zhì)同質(zhì)異核不育材料之間,在四種限制性內(nèi)切酶酶切圖譜中沒有差異。但兩類ogu型不育中均檢測到線粒體結(jié)構(gòu)的變異,第一組Ogu型細(xì)胞質(zhì)線粒體在8個(gè)材料中發(fā)現(xiàn)有1份材料出現(xiàn)了

11、酶切圖譜的變化；第二組Ogu型細(xì)胞質(zhì)線粒體中8個(gè)材料中發(fā)現(xiàn)了3份不育材料出現(xiàn)了相同的酶切圖譜上的變化。線粒體的結(jié)構(gòu)受核背景的影響,并且趨向于在相同的位點(diǎn)發(fā)生重排。
　　 (7)對同質(zhì)異核的不育材料ATP和POD同工酶的分析表明,Nap型細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料中ATP同工酶相對保持系,在花蕾發(fā)育后期酶活性顯著降低,部分材料還表現(xiàn)出譜帶的缺失。兩組Ogu型細(xì)胞質(zhì)不育材料在花蕾發(fā)育不同階段ATP酶活性基本一致。但在花蕾發(fā)育后期同樣有部分核