蝶蛹金小蜂毒液抑制菜粉蝶蛹免疫反應(yīng)的分子機(jī)理研究.pdf

1、有關(guān)寄生蜂及其寄主昆蟲之間的相互關(guān)系的研究備受重視，究其原因主要有兩點(diǎn)：第一，研究者對于寄生蜂-寄主間相互作用的機(jī)理十分感興趣；其次，寄生蜂作為生物防治的資源已被廣泛的應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展中。蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum(膜翅目Hymenoptera：金小蜂科Pteromalidae)為聚寄生性內(nèi)寄生蜂，其雌蜂于產(chǎn)卵過程中將毒液注入寄主體內(nèi)，且其生殖系統(tǒng)中無多分DNA病毒存在，毒液為其關(guān)鍵因子，用于調(diào)控寄主。因此

2、，蝶蛹金小蜂及其寄主菜粉蝶Pieris rapae(鱗翅目Lepidoptera：粉蝶科Pieridae)蛹之系統(tǒng)為深入研究內(nèi)寄生蜂毒液影響寄主蛹生理學(xué)反應(yīng)的機(jī)理提供了極佳的模型。蝶蛹金小蜂毒液能夠抑制寄主的免疫反應(yīng)，但有關(guān)其抑制作用的內(nèi)在機(jī)理仍不十分清楚。有鑒于此，本論文就其毒液抑制菜粉蝶蛹免疫反應(yīng)的分子機(jī)理開展系統(tǒng)研究，并取得以下主要結(jié)果：
　　 (1)明確毒液能夠影響菜粉蝶蛹兩個(gè)主要免疫效應(yīng)器血細(xì)胞及脂肪體中的基因轉(zhuǎn)錄。注

3、射毒液后1 h，我們從血細(xì)胞的正向抑制性消減雜交文庫中篩選獲得了217個(gè)EST克隆(共指向113個(gè)基因序列，其中62個(gè)為未知序列)，同時(shí)也從脂肪體的正向文庫中篩選獲得了288個(gè)EST克隆(共指向221個(gè)基因序列，其中123個(gè)為未知序列)，說明上述EST克隆所指向基因的轉(zhuǎn)錄水平均會(huì)被毒液下調(diào)。對已知基因序列進(jìn)行功能注釋，發(fā)現(xiàn)其分別與昆蟲免疫反應(yīng)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期與凋亡、代謝、運(yùn)輸、應(yīng)激反應(yīng)以及轉(zhuǎn)錄與翻譯調(diào)控等功能相關(guān)。爾后，我們又采用R

4、T-PCR對隨機(jī)選擇的候選基因進(jìn)行了半定量分析，驗(yàn)證結(jié)果表明，絕大部分候選基因的轉(zhuǎn)錄水平均被毒液所下調(diào)，這說明抑制性消減雜交結(jié)果是可信的。
　　 (2)明確毒液能夠下調(diào)菜粉蝶蛹天蠶素及溶菌酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，并能抑制其血淋巴的抗菌活性。抑菌圈測定結(jié)果表明，與對照相比，寄生或注射SephadexA-50微珠的蛹血淋巴抗菌活性顯著上升，毒液對誘導(dǎo)后的抗菌活性存在顯著的抑制作用。對正向抑制性消減雜交文庫進(jìn)行篩選，分別獲得了編碼菜粉蝶蛹天

5、蠶素及溶菌酶的全長cDNAs。多序列比對分析結(jié)果表明，它們的推導(dǎo)氨基酸序列分別與其它鱗翅目昆蟲的天蠶素與溶菌酶的較為近緣。rq-rtPCR(relativequantitative real time PCR)結(jié)果表明，與對照相比，經(jīng)藤黃微球菌、大腸桿菌及微珠誘導(dǎo)后天蠶素及溶菌酶基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯上升，毒液對其存在明顯的抑制作用。經(jīng)微珠誘導(dǎo)后，天蠶素基因于處理后8 h達(dá)到轉(zhuǎn)錄高峰爾后逐漸下降，而溶菌酶基因則于處理后24 h達(dá)到轉(zhuǎn)錄高峰爾

6、后逐漸下降。天蠶素及溶菌酶基因的轉(zhuǎn)錄存在組織特異性，它們在蛹顆粒血細(xì)胞及脂肪體中的轉(zhuǎn)錄水平較高。注射dsRNA(double-strand RNA)可降低兩基因的轉(zhuǎn)錄水平，并能下調(diào)處理蛹血淋巴的抗菌活性，這表明天蠶素與溶菌酶基因的表達(dá)產(chǎn)物具抗菌活性。毒液抑制天蠶素及溶菌酶基因轉(zhuǎn)錄具有明顯的時(shí)間效應(yīng)，處理后0-8 h，毒液均能有效抑制兩基因的轉(zhuǎn)錄，8 h后毒液的抑制作用逐漸喪失。同時(shí)，毒液抑制兩基因的轉(zhuǎn)錄具有明顯的劑量效應(yīng)，毒液濃度越高，

7、抑制作用越強(qiáng)。此外，重組表達(dá)的天蠶素及溶菌酶對蝶蛹金小蜂出蜂率無顯著影響。
　　 (3)明確毒液能夠下調(diào)菜粉蝶蛹原酚氧化酶激活蛋白(prophenol oxidaseactivating proteinase，PAP)基因的表達(dá)，能抑制其血淋巴原酚氧化酶(prophenoloxidase，proPO)的激活反應(yīng)，但并不抑制proPO基因的表達(dá)及酚氧化酶(phenoloxidase，PO)自身的活性。PO活性測定結(jié)果表明，與對照相

8、比，寄生并不能誘導(dǎo)蛹血淋巴PO活性升高，注射微珠則能誘導(dǎo)PO活性升高。毒液對誘導(dǎo)后的PO活性具有顯著的抑制作用，并通過生理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，其作用靶標(biāo)為proPO激活級聯(lián)反應(yīng)，而非PO本身。對文庫進(jìn)行篩選并結(jié)合RACE(Rapid amplificationof the end of the full-length cDNAs)反應(yīng)，分別獲得了編碼菜粉蝶蛹PAP1、PAP2及proPO亞基1的全長cDNAs。多序列比對分析結(jié)果表明，它們的推導(dǎo)

9、氨基酸序列分別與其它鱗翅目昆蟲的PAP及proPO亞基的近緣。rq-rtPCR及westernblotting結(jié)果表明，與對照相比，經(jīng)藤黃微球菌、大腸桿菌及微珠誘導(dǎo)后3個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平明顯上升，毒液對PAP1和PAP2基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平存在明顯的抑制作用，而對proPO亞基1基因無顯著影響。經(jīng)微珠誘導(dǎo)后，3個(gè)基因均于處理后4 h達(dá)到轉(zhuǎn)錄與表達(dá)高峰爾后逐漸下降。3個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)存在組織特異性，其中PAP1和PAP2基因在蛹顆粒

10、血細(xì)胞與脂肪體中的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平較高，而proPO亞基1基因則在血細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平較高。注射dsRNA可降低3個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平，并能下調(diào)處理蛹血淋巴的PO活性，這表明它們的表達(dá)產(chǎn)物參與血淋巴的黑化。毒液抑制PAP1和PAP2基因轉(zhuǎn)錄具有明顯的時(shí)間效應(yīng)，處理后0-8 h，毒液均能有效抑制兩基因的轉(zhuǎn)錄，8 h后毒液的抑制作用逐漸喪失。同時(shí)，毒液抑制兩基因的轉(zhuǎn)錄具有明顯的劑量效應(yīng)，毒液濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。
　　 (4)

11、明確毒液能夠下調(diào)菜粉蝶蛹清道夫受體基因的表達(dá)，并能抑制蛹血細(xì)胞的吞噬反應(yīng)。吞噬率測定結(jié)果表明，與對照相比，寄生及毒液處理能顯著降低蛹血細(xì)胞的吞噬能力。對文庫進(jìn)行篩選并結(jié)合RACE反應(yīng)，獲得了編碼菜粉蝶蛹清道夫受體的全長cDNA。多序列比對分析結(jié)果表明，其推導(dǎo)氨基酸序列分別與其它鱗翅昆蟲的清道夫受體的近緣。rq-rtPCR及western blotting結(jié)果表明，與對照相比，經(jīng)藤黃微球菌、大腸桿菌及微珠誘導(dǎo)后該基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平明顯上

12、升，毒液對其轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平存在明顯的抑制作用。經(jīng)微珠誘導(dǎo)后，該基因于處理后4 h達(dá)到轉(zhuǎn)錄與表達(dá)高峰爾后逐漸下降。該基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)存在組織特異性，其在蛹顆粒血細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平較高。亞細(xì)胞定位及western blotting結(jié)果表明，該基因的表達(dá)產(chǎn)物被定位于顆粒血細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜上，且不能被分泌至蛹血漿中，毒液可抑制該基因在顆粒血細(xì)胞中表達(dá)。注射dsRNA可降低該基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平，并能下調(diào)處理蛹血細(xì)胞的吞噬與包囊能力，這表

13、明其表達(dá)產(chǎn)物不僅參與細(xì)胞吞噬反應(yīng)，也同時(shí)參與包囊反應(yīng)。毒液抑制該基因轉(zhuǎn)錄具有明顯的時(shí)間效應(yīng)，處理后0-8 h，毒液均能有效抑制其轉(zhuǎn)錄，8 h后毒液的抑制作用逐漸喪失。同時(shí)，毒液抑制該基因的轉(zhuǎn)錄具有明顯的劑量效應(yīng)，毒液濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。
　　 (5)明確毒液能夠下調(diào)菜粉蝶蛹C型凝集素基因的表達(dá)，該基因表達(dá)水平的下調(diào)會(huì)降低蛹血淋巴的抗菌及酚氧化酶活性，以及血細(xì)胞的吞噬與包囊能力。對文庫進(jìn)行篩選并結(jié)合RACE反應(yīng)，獲得了編碼菜粉

14、蝶蛹C型凝集素的全長cDNA。多序列比對分析結(jié)果表明，其推導(dǎo)氨基酸序列與其它鱗翅昆蟲的C型凝集素的近緣。rq-rtPCR及western blotting結(jié)果表明，與對照相比，經(jīng)藤黃微球菌、大腸桿菌及微珠誘導(dǎo)后該基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平明顯上升。毒液對其轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平存在明顯的抑制作用。經(jīng)微珠誘導(dǎo)后，該基因于處理后4 h達(dá)到轉(zhuǎn)錄與表達(dá)高峰爾后逐漸下降。該基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)存在組織特異性，其在蛹顆粒血細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平較高。亞細(xì)胞定位及we

15、stern blotting結(jié)果表明，該基因可能位于蛹顆粒血細(xì)胞的顆粒中表達(dá)，并能被分泌至蛹血漿中。誘導(dǎo)表達(dá)后8 h，血漿中的C型凝集素能與漿血細(xì)胞膜結(jié)合，毒液能抑制該基因在蛹顆粒血細(xì)胞中的表達(dá)。注射dsRNA可降低該基因的轉(zhuǎn)錄水平，并能下調(diào)處理蛹血淋巴的抗菌與酚氧化酶活性，以及血細(xì)胞的吞噬與包囊能力，這表明其表達(dá)產(chǎn)物很可能參與了寄主的非我識別過程。毒液抑制該基因轉(zhuǎn)錄具有明顯的時(shí)間效應(yīng)，處理后0-8 h，毒液均能有效抑制其轉(zhuǎn)錄，8 h后