椰扁甲嚙小蜂毒液蛋白Tbserpin6抑制水椰八角鐵甲蛹原酚氧化酶反應(yīng)的機(jī)理.pdf

1、寄生蜂在與寄主長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的過程中建立了一套完整的寄生策略用以突破寄主免疫屏障，這是寄生蜂成功寄生的第一步。在不含多分DNA病毒（PDV）的寄生蜂中，毒液被證明能夠調(diào)控寄主的免疫反應(yīng)，如黑化反應(yīng)。免疫反應(yīng)響應(yīng)過程中的一些有害中間產(chǎn)物會(huì)對(duì)機(jī)體造成傷害，但絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpin）能對(duì)絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用防止免疫過度。在寄生蜂的毒液組分中存在絲氨酸蛋白酶抑制劑及絲氨酸蛋白酶抑制劑類似物，可以調(diào)節(jié)酚氧化酶原激活因子（

2、PPAF）的活性，從而調(diào)控寄主酚氧化酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終調(diào)節(jié)寄主黑化反應(yīng)。在研究椰扁甲嚙小蜂Tetrastichus brontispae毒液組分的過程中，發(fā)現(xiàn)其毒液中存在一個(gè)較高豐度的絲氨酸蛋白酶抑制劑Tbserpin6，因其與寄主水椰八角鐵甲Octodonta nipae中的絲氨酸蛋白酶抑制劑Onserpin6結(jié)構(gòu)相似，推測(cè)椰扁甲嚙小蜂毒液蛋白Tbserpin6在調(diào)控寄主免疫反應(yīng)的過程中具有重要作用。
　　為了驗(yàn)證椰扁甲嚙小蜂毒液

3、蛋白Tbserpin6調(diào)節(jié)寄主水椰八角鐵甲酚氧化酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的功能及其可能的調(diào)控機(jī)理，本文克隆了椰扁甲嚙小蜂毒液蛋白Tbserpin6和水椰八角鐵甲Onserpin6、OnPPAF1，并進(jìn)行體外重組表達(dá)驗(yàn)證Tbserpin6、Onserpin6和OnPPAF1在水椰八角鐵甲酚氧化酶激活反應(yīng)中的作用，主要研究結(jié)果如下：
　?。?）克隆獲得Tbserpin6、Onserpin6和OnPPAF1的全長(zhǎng)序列分別為969 bp、1248 bp

4、和1164 bp，分別編碼323、416和388個(gè)氨基酸。將OnPPAF1的氨基酸序列與其他昆蟲的酚氧化酶原激活蛋白酶（PPAF、PPAE和PAP）進(jìn)行序列比對(duì)以及系統(tǒng)進(jìn)化分析得知，OnPPAF1為trypsin-like絲氨酸蛋白酶具有典型的N-端“clip”結(jié)構(gòu)域以及C-端絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，屬CLIPB族成員，具有酰胺酶活性，能激活酚氧化酶酶原。Tbserpin6與Onserpin6同屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員，兩者的反應(yīng)中心

5、環(huán)（RCL）具有較高的相似度，且它們的底物結(jié)合位點(diǎn)P1-P1'都是精氨酸和異亮氨酸，推測(cè)Tbserpin6與Onserpin6都能夠調(diào)控水椰八角鐵甲的酚氧化酶原的激活反應(yīng)。
　?。?）利用RNAi技術(shù)驗(yàn)證了OnPPAF1在水椰八角鐵甲酚氧化酶反應(yīng)中的作用。注射dsOnPPAF1至水椰八角鐵甲蛹體內(nèi)后24 h，其血淋巴的酚氧化酶活性及黑化反應(yīng)受到明顯抑制，上述結(jié)果表明OnPPAF1在水椰八角鐵甲的黑化反應(yīng)中起著重要作用。
　　

6、（3）重組蛋白互作結(jié)果表明，Tbserpin6和Onserpin6均能與OnPPAF1互作形成共價(jià)復(fù)合物。重組蛋白Tbserpin6和Onserpin6能夠抑制重組蛋白OnPPAF1的酰胺酶活性，還能抑制水椰八角鐵甲蛹血淋巴酚氧化酶活性與黑化反應(yīng)。
　　綜上，OnPPAF1是水椰八角鐵甲酚氧化酶反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，Onserpin6與Tbserpin6皆能同OnPPAF1結(jié)合進(jìn)而對(duì)該酚氧化酶反應(yīng)起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。椰扁甲嚙小蜂調(diào)控寄主