PRRSV變異株的分離鑒定、鑒別診斷和新型基因疫苗的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的病毒性傳染病，以成年母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為主要特征。2006年5月份開始，主要由PRRSV Nsp2缺失變異株引起的以高熱、呼吸困難為主要癥狀，高發(fā)病率和高死亡

2、率為顯著特征的豬“高熱”綜合征，給我國南方養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失的。準(zhǔn)確、可靠的檢測技術(shù)和安全、高效的疫苗是預(yù)防和控制PRRS的關(guān)鍵，也是目前豬病研究的熱點(diǎn)。本研究從四川發(fā)病豬場分離鑒定一株P(guān)RRSV Nsp2缺失變異株，建立了對PRRSV Nsp2缺失變異株的病原學(xué)和血清學(xué)檢測方法，克隆出豬前胸腺素(ProTa)，并將其作為分子佐劑，構(gòu)建攜帶GP5-ProTa融合基因的減毒沙門氏菌活載體疫苗，初步取得了如下研究結(jié)果：
　　

3、1.豬繁殖與呼吸綜合征病毒SCMS08株分離鑒定
　　 用Marc-145細(xì)胞分離了PRRSV四川變異株（SCMS08株），對其生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究。通過對其Nsp2高變區(qū)和GP5全基因進(jìn)行了序列測定，發(fā)現(xiàn)與JXA1株同源性最高，核苷酸和推導(dǎo)氨基酸同源性分別高達(dá)99.7％、99.8％和99.2％、99.3％。遺傳進(jìn)化樹分析顯示所分離毒株與JXA1等為代表的PRRSV Nsp2缺失親緣關(guān)系最近。
　　 2.對PRRSV

4、快速分型的多重RT-PCR方法的建立及四川PRRSV遺傳進(jìn)化分析
　　 利用生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)三對特異性檢測引物，成功建立能夠同時(shí)檢測PRRSV歐洲株，美洲經(jīng)典株和Nsp2缺失變異株的多重RT-PCR方法。并用所建立的方法對四川各地送檢的76份PRRS疑似病料進(jìn)行檢測，結(jié)果PRRSV總的檢出率達(dá)到60％，其中變異株為53.9％，未檢出歐洲株。在檢測出的陽性病料中選取有代表性的9株病毒，對其Nsp2高變區(qū)進(jìn)行克隆，并進(jìn)行了序列測定，序

5、列分析結(jié)果顯示，這9株P(guān)RRSV之間同源性極高，與國內(nèi)分離株JXA1的親緣關(guān)系最高。
　　 3.PRRSV Nsp2高變區(qū)B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位的鑒定及間接ELISA方法的鑒定
　　 通過生物信息學(xué)方法對SCMS08株Nsp2高變區(qū)域二級結(jié)構(gòu)和抗原表位進(jìn)行預(yù)測分析。根據(jù)預(yù)測結(jié)果設(shè)計(jì)4對引物對Nsp2高變區(qū)進(jìn)行分段克隆，并成功構(gòu)建4個(gè)原核表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，均獲得高效表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE結(jié)果顯示4個(gè)融合蛋白的大小分別

6、約是63、35、26、27ku，與預(yù)期大小一致。Western blot結(jié)果顯示，4個(gè)融合蛋白均能與PRRSV Nsp2缺失變異株陽性血清反應(yīng)，但其中Nsp2-4反應(yīng)較弱。在PRRSV SCMS08株Nsp2中部區(qū)域發(fā)現(xiàn)兩個(gè)強(qiáng)抗原表位。將4個(gè)融合蛋白經(jīng)鎳柱純化后，分別建立ELISA檢測方法。通過對血清樣品的檢測發(fā)現(xiàn)，Nsp2-1、Nsp2-2、Nsp2-3、Nsp2-4對于PRRSV經(jīng)典株血清樣品的識別率分別為84.6％、77.4％、2

7、1.3％和52.1％；對PRRSV Nsp2缺失變異株的識別率分別為100％、100％、77.6％和63.2％。以Nsp2-1融合蛋白為包被抗原的ELISA方法對經(jīng)典株和變異株血清均有較高的敏感性，證明通過Nsp2作為診斷抗原建立ELISA診斷方法可行。為進(jìn)一步研究區(qū)分美洲型PRRSV經(jīng)典株和Nsp2缺失變異株的血清學(xué)方法奠定了基礎(chǔ)。
　　 4.豬前胸腺素的克隆和表達(dá)研究
　　 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從豬腎臟中擴(kuò)增到豬前胸

8、腺素基因，經(jīng)測序鑒定正確后，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32-mProTa，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)Rosetta2(DE3)。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，初步純化目的蛋白，SDS-PAGE電泳和免疫印跡分析鑒定結(jié)果。豬前胸腺素完整開放閱讀框(ORF)，共333bp，編碼109aa，與已公布的2個(gè)豬前胸腺素基因核苷酸同源性均為99.4％。SDS-PAGE電泳和免疫印跡分析顯示，重組蛋白以包涵體形式表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物約占菌體總蛋白的40％，相對分

9、子量約為12ku。MTT法試驗(yàn)證實(shí)，表達(dá)產(chǎn)物初步純化、透析復(fù)性后，可明顯增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的增殖。將ProTa連接到pEGFP-N3真核表達(dá)載體，構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-ProTa。通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，進(jìn)行熒光檢測。結(jié)果顯示，構(gòu)建的pEGFP-ProTa真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后，經(jīng)熒光觀察EGFP-ProTa融合蛋白有向細(xì)胞核聚集的現(xiàn)象。
　　 5.減毒沙門氏菌介導(dǎo)的豬ProTα與PRRSV-GP5二聯(lián)基因疫苗的免

10、疫學(xué)研究
　　 分別構(gòu)建了pCI-GP5、pCI-ProTa和pCI-GP5-ProTa真核表達(dá)載體。將pCI-GP5、pCI-ProTa和pCI-GP5-ProTa真核載體轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后，采用RT-PCR檢測重組載體在Vero細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄情況；同時(shí)通過間接免疫熒光檢測方法pCI-GP5和pCI-GP5-ProTa，進(jìn)一步證實(shí)了核酸疫苗在Vero細(xì)胞中獲得了高效表達(dá)。小鼠實(shí)驗(yàn)表明pCI-GP5-ProTa免疫組和pCI-GP