煙草表皮毛蛋白NtTTG1與轉(zhuǎn)錄因子AtMYB44調(diào)控植物防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制.pdf

1、自然界中的植物經(jīng)常遭受病原菌或病原激發(fā)子的侵襲,而植物利用自身的先天免疫系統(tǒng)形成一套復(fù)雜而有效的防御機(jī)制來(lái)抵御這種侵害,這些機(jī)制包括過(guò)敏性細(xì)胞死亡(hypersensitive cell death,HCD)和系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)。HCD又叫過(guò)敏反應(yīng)(hypersensitive response,HR),是植物抗病反應(yīng)的一種典型癥狀,可在24h內(nèi)觀察到。其特征是病原菌所侵染

2、部位的細(xì)胞呈現(xiàn)快速枯死,病原菌得不到營(yíng)養(yǎng)而致其不能生長(zhǎng)和擴(kuò)散。HR的產(chǎn)生與兩種類(lèi)型的病原菌與植物產(chǎn)生互作有關(guān):一種是病原菌與寄主之間的不親和互作(avr-R)；另外一種是由病原菌與非寄主植物的互作所引起。已有研究表明,病原真菌中引起非寄主過(guò)敏性反應(yīng)的物質(zhì)主要是由疫霉屬病原菌所產(chǎn)生的激發(fā)子 elicitins。ParA1是由寄生疫霉 Phytophthraparasitica var nicotianae分泌產(chǎn)生的一種 elicitin。

3、ParA1處理煙草葉片的表皮毛,可以引起表皮毛細(xì)胞發(fā)生一系列的HCD相關(guān)反應(yīng)。這表明,表皮毛中存在著一套接受外源激發(fā)子ParA1信號(hào)的分子機(jī)制。那么,ParA1是如何被植物體識(shí)別的?表皮毛發(fā)育蛋白NtTTG1是如何參與到ParA1引發(fā)的HCD過(guò)程之中的?
　　 轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中遭受的各種生物和非生物脅迫的過(guò)程中起重要的作用。轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與其調(diào)控的下游基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件結(jié)合而直接調(diào)控靶基因的表達(dá),或形成同源

4、、異源二聚體,或與其它蛋白互作成為某種活化形式而參與乙烯、水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)與脫落酸(ABA)等信號(hào)傳導(dǎo)途徑,形成復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),提高植物對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力。HrpNEa是由梨火疫病原細(xì)菌Erwinia amylovora產(chǎn)生的一種蛋白激發(fā)子。外施HrpNEa能夠誘導(dǎo)擬南芥中多種轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá),也可以通過(guò)激發(fā)不同信號(hào)通路,誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病,抗蟲(chóng)、抗旱以及促生長(zhǎng)等多種有利表型。EIN2(ethylene insens

5、itive2)是乙烯信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子,那么,轉(zhuǎn)錄因子和EIN2之間會(huì)有什么樣的聯(lián)系?轉(zhuǎn)錄因子在乙烯信號(hào)傳導(dǎo)通路中起到什么作用?
　　 本研究著重剖析NtTTG1在ParA1引發(fā)的煙草過(guò)敏細(xì)胞死亡中的作用機(jī)制以及AtMYB44參與乙烯信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用機(jī)制。
　　 1、ParA1與功能缺失蛋白C51S的獲得及其功能驗(yàn)證
　　 根據(jù)以往的研究得知,蛋白激發(fā)子ParA1注射煙草葉片,可以引發(fā)過(guò)敏性細(xì)胞死亡；噴施煙

6、草葉片時(shí),可以引發(fā)肉眼不可見(jiàn)的微敏反應(yīng)(microscopic hypersenseitveresponse,micro-HR),并伴隨有活性氧爆發(fā)(ROS burst)和染色質(zhì)凝集現(xiàn)象(claromatincondensation,Cc)的發(fā)生。ParA1中含有6個(gè)保守的半胱氨酸,且兩兩結(jié)合形成三對(duì)二硫鍵維持著對(duì)于ParA1的功能行使所必需的特異的空間構(gòu)象。本研究主要通過(guò)點(diǎn)突變(site directed msltagenesis)的

7、方法將ParA1中的第51位半胱氨酸替換為絲氨酸,得到了基因C51S,經(jīng)原核表達(dá)得到了點(diǎn)突變蛋白C51S。通過(guò)與對(duì)照ParA1的功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),C51S完全喪失了在煙草葉片上誘導(dǎo)HR的能力。而且DAB、trypan blue和DAPI染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),C51S處理表皮毛12h后,仍檢測(cè)不到氧爆發(fā)、微敏反應(yīng)和染色質(zhì)凝集現(xiàn)象的發(fā)生。這些結(jié)果都表明,C51S已經(jīng)完全喪失其生物功能。
　　 2、ParA1與NtTTG1在煙草表皮毛細(xì)胞的細(xì)胞膜

8、附近的相互作用
　　 根據(jù)擬南芥中參與葉片表皮毛發(fā)育的幾個(gè)關(guān)鍵基因,在煙草中篩選可以受ParA1誘導(dǎo)表達(dá)的同源物。發(fā)現(xiàn)只有AtTTG1的同源物受誘導(dǎo)表達(dá),并依此克隆到NtTTG1基因。NtTTG1在表皮毛中被ParA1誘導(dǎo)表達(dá)的程度明顯強(qiáng)于葉肉細(xì)胞。并通過(guò)酵母雙雜交和pull-down assay證明了ParA1與NtTTG1可以發(fā)生互作,而C51S與NtTTG1卻不能相互作用。蛋白結(jié)構(gòu)分析表明,51位的半胱氨酸位于ParA1蛋

9、白的邊緣,這個(gè)位置很可能在與其它蛋白的互作中起作用。ParA1與NtTTG1之間的互作經(jīng)兩個(gè)蛋白在植物表皮毛中的亞細(xì)胞定位而得到進(jìn)一步驗(yàn)證。將融合有紅色熒光蛋白R(shí)FP的NtTTG1在煙草中瞬時(shí)表達(dá),這個(gè)融合基因瞬時(shí)表達(dá)12h后在煙草表皮毛中有大量的轉(zhuǎn)錄。熒光觀察表明,NtTTG1-RFP明顯的定位在煙草表皮毛細(xì)胞的細(xì)胞膜上。而且熒光疊加結(jié)果表明,ParA1-eGFP可以與NtTTG1-RFP相結(jié)合,而C51S-eGFP不能與之結(jié)合。雙分

10、子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證了熒光疊加的結(jié)果,而且,這種互作發(fā)生在表皮毛細(xì)胞的細(xì)胞膜附近。
　　 3、煙草葉片表皮毛在ParA1引發(fā)過(guò)敏性細(xì)胞死亡過(guò)程中的導(dǎo)航作用
　　 表皮毛作為煙草最外部的第一道天然屏障,勢(shì)必最早接觸蛋白激發(fā)子ParA1,并參與其誘導(dǎo)的過(guò)敏性細(xì)胞死亡(hypersensitive cell death,HCD)過(guò)程。我們以HCD發(fā)生過(guò)程中的重要信號(hào)分子H2O2和細(xì)胞內(nèi)的染色質(zhì)凝集為切入點(diǎn),確定了表皮毛對(duì)

11、于ParA1激發(fā)子誘導(dǎo)HCD的響應(yīng)(見(jiàn)本博士論文研究報(bào)告第一章)。DCFH-DA染色及熒光觀察結(jié)果表明,ParA1處理后1h,表皮毛內(nèi)發(fā)生氧爆發(fā),這比葉肉細(xì)胞早2h,其產(chǎn)生的活性氧還有向下部葉肉細(xì)胞傳導(dǎo)的趨勢(shì)。同時(shí),藥物抑制實(shí)驗(yàn)證明了活性氧的主要成份是H2O2。DAPI熒光分析表明,表皮毛內(nèi)染色質(zhì)凝集的發(fā)生要比葉肉細(xì)胞早5 h左右。Trypan blue染色,并配合質(zhì)壁分離實(shí)驗(yàn),結(jié)果證明,在ParA1處理后1h到12h中,細(xì)胞死亡從表皮

12、毛向底部細(xì)胞逐漸擴(kuò)散,表皮毛細(xì)胞死亡發(fā)生比葉肉細(xì)胞早大約5 h,且表皮毛在每個(gè)時(shí)間段內(nèi)的細(xì)胞死亡數(shù)都高于葉肉細(xì)胞。RT-PCR方法檢測(cè)了HCD反應(yīng)中的標(biāo)志基因PAL、hin1和hsr203的表達(dá),三個(gè)基因在ParA1處理12 h后的表皮毛中都有明顯表達(dá),而在葉肉細(xì)胞內(nèi)表達(dá)稍晚一些。這些結(jié)果表明,HCD信號(hào)是從表皮毛向葉肉細(xì)胞中傳導(dǎo)的。
　　 4、介導(dǎo)HrpNEa誘導(dǎo)擬南芥抗綠桃蚜作用的37個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的初步篩選
　　 Hr

13、pNEa是由病原細(xì)菌產(chǎn)生的一類(lèi)barpin蛋白質(zhì),它可以通過(guò)激發(fā)不同信號(hào)通路,誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病、抗蟲(chóng)、抗旱以及促生長(zhǎng)等多種有利表型。HrpNEa處理擬南芥可以通過(guò)激活乙烯信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)植物對(duì)綠桃蚜的抗性反應(yīng)。EIN2是乙烯信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,在誘導(dǎo)抗蟲(chóng)反應(yīng)中起重要作用。為了闡明乙烯信號(hào)在誘導(dǎo)抗蟲(chóng)反應(yīng)中的調(diào)控機(jī)制,我們對(duì)在擬南芥上由乙烯誘導(dǎo)的37個(gè)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了研究。HrpNEa處理野生型Col-0后,與對(duì)照相比,發(fā)現(xiàn)有22個(gè)基因被

14、上調(diào)表達(dá),4個(gè)被下調(diào),還有9個(gè)沒(méi)有變化,其中AtMYB44的上調(diào)表達(dá)度最強(qiáng)。通過(guò)研究37個(gè)轉(zhuǎn)錄因子突變體中蚜蟲(chóng)趨避以及蚜蟲(chóng)繁殖情況時(shí)發(fā)現(xiàn),有24種突變體和野生型差不多,有4種抗性增強(qiáng),還有9種抗性減弱。atmyb44對(duì)蚜蟲(chóng)的趨避性減弱程度最為明顯,而且削弱了HrpNEa誘導(dǎo)的抗蟲(chóng)反應(yīng)。我們又分別檢測(cè)了乙烯信號(hào)通路的標(biāo)志基因 PDF1.2的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)其在野生型中表達(dá),但在atmyb44和另外的4種突變體里不表達(dá),這說(shuō)明了乙烯信號(hào)通路已

15、被阻斷。本研究證明了擬南芥突變體atmyb44能消除HrpNEa誘導(dǎo)的EIN2基因的表達(dá),從而說(shuō)明了AtMYB44與EIN2有著很緊密的聯(lián)系。
　　 5、轉(zhuǎn)錄因子AtMYB44與EIN2的互作研究
　　 AtMYB44是擬南芥MYB家族的一種轉(zhuǎn)錄因子,可以對(duì)乙烯信號(hào)發(fā)生感應(yīng),從而介入植物防衛(wèi)反應(yīng)。植物防衛(wèi)反應(yīng)經(jīng)常受乙烯信號(hào)傳導(dǎo)支配,而乙烯信號(hào)的中心調(diào)控因子是EIN2。目前,對(duì)AtMYB44調(diào)控的蛋白靶標(biāo)及EIN2的作用機(jī)

16、理的研究,都還不夠深入。通過(guò)遺傳學(xué)、藥理學(xué)及微生物學(xué)等方法,我們發(fā)現(xiàn)AtMYB44、EIN2和乙烯在對(duì)HrpNEa誘導(dǎo)擬南芥對(duì)蚜蟲(chóng)產(chǎn)生抗性的過(guò)程中都是必需的因子。本研究通過(guò)gelmobility shift assay(GMSA)和chromatin immunoprecipitation assay(ChIP)兩種方式證明了AtMYB44與EIN2能在植物體外體內(nèi)產(chǎn)生互作。
　　 6、轉(zhuǎn)基因雙突變體 ein2-1 atpp2-

17、a1和 ein2-1 abi2-1的產(chǎn)生與鑒定
　　 擬南芥AtPP2類(lèi)韌皮部蛋白是一種獨(dú)特的結(jié)合幾丁質(zhì)的凝集素,其氨基酸序列高度保守且均有韌皮部組織特異性,對(duì)刺吸式昆蟲(chóng)的侵襲有著特殊的防衛(wèi)功能,在植物韌皮部相關(guān)防衛(wèi)(plant phloem-related defense,PRD)反應(yīng)過(guò)程中起重要作用。逆境激素脫落酸(ABA)能調(diào)控植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)過(guò)程中的氣孔關(guān)閉、抵抗逆境、種子后熟和休眠等許多重要事件。乙烯是植物生長(zhǎng)發(fā)

18、育重要的內(nèi)源信號(hào)分子,其介導(dǎo)的植物抗病防衛(wèi)基本信號(hào)通路對(duì)于植物的基本防衛(wèi)十分重要。而EIN2是乙烯信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本研究通過(guò)RNAi介導(dǎo)的基因沉默的轉(zhuǎn)化方法,構(gòu)建了AtPP2-A1與ABI2基因的沉默發(fā)夾結(jié)構(gòu),分別轉(zhuǎn)化擬南芥乙烯不敏感突變體 ein2-1,將AtPP2-A1與ABI2基因沉默,成功獲得了雙突變體品系 ein2-1 atpp2-a1和ein2-1 sni2-1。為深入研究植物乙烯與 PRD、ABA信號(hào)通路在植物防