雌激素及chOPG對雞胚BMSCs誘導的成骨細胞增殖、凋亡、細胞周期以及BGP與Col I mRNA表達的影響.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低下和骨結(jié)構(gòu)破壞為特征的疾病,可導致骨強度降低,骨折危險性增加。骨保護素(OPG)屬于TNF受體家族成員,主要由骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)和成骨細胞(OB)分泌,能抑制破骨細胞(OC)生成、活化,減少骨吸收,增加骨密度。骨髓間充質(zhì)干細胞和成骨細胞均可表達雌激素受體α和β,故雌激素可能對骨髓基質(zhì)細胞和成骨細胞的分化和功能有直接作用。骨髓間充質(zhì)干細胞來源于骨髓基質(zhì)的一種間充質(zhì)細胞,它具有多種分化潛能,可向成骨細胞、

2、成纖維細胞、脂肪細胞等方向分化。骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化過程需要誘導成骨細胞條件培養(yǎng)基。雌激素、OPG和BMSCs三者之間的緊密聯(lián)系及相互作用,為探討蛋雞髓質(zhì)骨形成、骨質(zhì)疏松的發(fā)病機理及其防治提供理論依據(jù)。
　　 試驗Ⅰ雞胚BMSCs的成骨細胞誘導培養(yǎng)與鑒定
　　 目的:探討18日齡雞胚骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)體外培養(yǎng)生長規(guī)律以及定向誘導分化為成骨細胞的條件和誘導的成骨細胞的功能。方法:沖洗脛骨骨髓,以全骨髓

3、貼壁法進行體外貼壁培養(yǎng)、傳代。取第三代細胞誘導培養(yǎng),同時設(shè)空白對照.倒置顯微鏡下觀察其形態(tài),通過MTT法測定細胞增殖率,經(jīng)Annexin V-FITC和PI染色后,用流式細胞儀檢測細胞周期情況。用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(BCIP)/氯化硝基四氮唑藍(NBT)底物顯色試劑檢測堿性磷酸酶(ALP),Van-Gieson染色檢測Ⅰ型膠原,茜素紅染色檢測鈣結(jié)節(jié)。結(jié)果:全骨髓貼壁培養(yǎng)法可獲得BMSCs,BMSCs和誘導的成骨細胞具有活躍的

4、增殖能力。誘導培養(yǎng)后,ALP檢測、Ⅰ型膠原染色與鈣化結(jié)節(jié)染色均為強陽性。結(jié)論:雞胚BMSCs易于體外分離培養(yǎng)、擴增,并可定向誘導為典型的成骨細胞。
　　 試驗Ⅱ17β-E2對雞胚BMSCs誘導的成骨細胞ALP活性、OPG、BGP與ColⅠ mRNA表達的影響
　　 目的:觀察17β-雌二醇(17β-E2)對雞胚骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(BMSCs)誘導的成骨細胞的作用,為探索髓質(zhì)骨形成及其蛋雞骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機理提供理論基礎(chǔ)

5、。方法:體外分離培養(yǎng)雞胚骨髓間充質(zhì)干細胞,利用貼壁法純化細胞。取第三代細胞進行成骨細胞誘導,將誘導的成骨細胞分為5個試驗組,分別添加含有10-7、10-8、10-9、10-10、10-11mol·濃度17β-E2的成骨細胞誘導培養(yǎng)基,同時設(shè)空白對照組。用MTT法測定不同濃度17β-E2下的生長曲線,利用PNPP法測定堿性磷酸酶活性,選擇其最有效濃度。并使用該有效濃度作用于誘導培養(yǎng)的成骨細胞,通過流式細胞術(shù)觀察該濃度17β-E2對成骨細胞

6、凋亡的影響；使用RT-PC賊術(shù)觀察17β-E2對誘導的成骨細胞OPG、骨鈣素(BGP)、Ⅰ型膠原(ColⅠ)的mRNA影響。結(jié)果:與對照組比較,17β-E2能夠促進誘導的成骨細胞增殖,ALP分泌,抑制成骨細胞凋亡,濃度為10-9 mol·L-1的17β-E2促進OPG、BGP與colⅠ mRNA表達,差異顯著。結(jié)論:10-9 mol·L-1的17β-E2可增強雞胚BMSCs誘導的成骨細胞功能。
　　 試驗Ⅲ chOPG對雞胚BM

7、SCs誘導的成骨細胞ALP活性及BGP與ColⅠ mRNA表達的影響
　　 目的:研究外源性雞骨保護素蛋白(chOPG)對雞胚BMSCs誘導的成骨細胞增殖、ALP活性、細胞凋亡及BGP-與ColⅠ mRNA的表達作用,探討其在蛋雞髓質(zhì)骨形成過程中的調(diào)節(jié)作用及其蛋雞骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機理提供理論基礎(chǔ)。方法:沖洗脛骨骨髓,以全骨髓貼壁法進行體外培養(yǎng),貼壁傳代。將第三代細胞誘導成成骨細胞培養(yǎng)。同時將誘導的成骨細胞分為3個試驗組,同時設(shè)立空

8、白對照,分別添加含有終濃度為4.0 mg·mL-1,0.4 mg·mL-1,0.04 mg·mL-13種濃度的chOPG的成骨細胞誘導分化液,用MTT法測定成骨細胞的增殖,利用PNPP法測定ALP,篩選出chOPG最有效濃度培養(yǎng)BMSCs誘導的成骨細胞,通過流式細胞術(shù)觀察其對成骨細胞凋亡的影響。使用RT-PCR技術(shù)觀察外源性chOPG對BMSCs誘導的成骨中BGP、ColⅠ的mRNA表達的影響。結(jié)果:獲得的骨髓間充質(zhì)干細胞細胞其生化指標

9、穩(wěn)定,骨髓間充質(zhì)干細胞成骨細胞分化后,ALP分泌明顯增加,可產(chǎn)生大量的礦化結(jié)節(jié),具有成熟成骨細胞的表型特征。加入外源性chOPG后,與對照組相比,試驗組成骨細胞的增殖、ALP分泌均顯著下降、細胞的凋亡增加。RT-PCR檢測顯示,與對照組相比,誘導培養(yǎng)基中chOPG為0.4 mg·mL-1時,誘導培養(yǎng)的成骨細胞BGP和colⅠ mRNA的表達顯著下降。結(jié)論:外源性chOPG對體外雞胚BMSCs誘導培養(yǎng)成骨細胞增殖、ALP分泌有抑制作用,對