小鼠非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列對(duì)外源基因表達(dá)的促進(jìn)作用的初步研究.pdf

1、核糖體基因非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ribosomal gene nontranscribed spacer，NTS)能促進(jìn)基因表達(dá)水平和延長(zhǎng)基因表達(dá)時(shí)間。本研究以綠色熒光蛋白(GFP)和NEO基因?yàn)閳?bào)告基因，構(gòu)建含小鼠NTS370bp序列的系列表達(dá)載體，根據(jù)報(bào)告基因表達(dá)情況來驗(yàn)證NTS序列在不同動(dòng)物細(xì)胞中的外源基因表達(dá)促進(jìn)作用。首先將NTS序列插入pEGFP-N1真核表達(dá)載體，獲得重組載體pEGFP-N1-NTS。然后在相同的條件下，分別用NTS

2、載體和對(duì)照載體轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞、NIH-3T3細(xì)胞和293T細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，pEGFP-N1-NTS轉(zhuǎn)染組的熒光陽性細(xì)胞數(shù)和熒光強(qiáng)度明顯高于pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組，表明小鼠NTS序列可促進(jìn)外源基因在不同來源細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)。
　　 PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)足較新的基因?qū)胂到y(tǒng)。為了進(jìn)一步提高其基因?qū)胄?，本研究先將小鼠NTS370bp序列插入PB轉(zhuǎn)座子載體pAAAV-PBTR-EGFP中，獲得新載體pAAAV-PBTR-

3、EGFP-NTS。然后分別用兩種轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒單獨(dú)或與PB轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體pAAAV-PBase共轉(zhuǎn)染不同來源的細(xì)胞系。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，pAAAV-PBTR-EGFP-NTS轉(zhuǎn)染組的熒光陽性細(xì)胞數(shù)及熒光強(qiáng)度高于pAAAV-PBTR-EGFP轉(zhuǎn)染組，pAAAV-PBTR-EGFP-NTS+pAAAV-PBase轉(zhuǎn)染組的熒光陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于pAAAV-PBTR-EGFP+pAAAV-PBase轉(zhuǎn)染組，表明小鼠NTS序列能以轉(zhuǎn)座酶依賴和非

4、依賴方式，促進(jìn)轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的外源基因在不同來源細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 將小鼠NTS370bp序列插入表達(dá)NEO基因的轉(zhuǎn)座子載體pAAAV-PBTR-NEO中，獲得新的表達(dá)載體pAAAV-PBTR-NEO-NTS。然后用兩種質(zhì)粒單獨(dú)或PB轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體pAAAV-PBase共轉(zhuǎn)染不同來源的細(xì)胞系，經(jīng)適當(dāng)濃度G418篩選兩周后，pAAAV-PBTR-NEO-NTS轉(zhuǎn)染組的抗性細(xì)胞克隆數(shù)多于pAAAV-PBTR-NEO轉(zhuǎn)染組，但差異不顯著